莱茵衣藻APC/C复合物基因家族及CrCDC20表达谱分析

罗秋兰，王潮岗，胡章立

1) 深圳大学生命与海洋科学学院，深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，广东深圳 518060；2) 深圳大学光电工程学院，光电子器件与系统教育部/广东省重点实验室，广东深圳 518060；3) 深圳大学龙华生物产业创新研究院，深圳市海洋藻类生物工程技术研究中心，广东深圳 518060；4) 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 570100

微藻是一类直径在2～200 μm，具有光合作用，分布于各种水体(海水和淡水)的生物[1]. 在能源危机和环境污染日益加剧的今天，微藻被认为是生产生物柴油的理想来源[2]. 由于生产成本居高不下，微藻生物柴油的发展受到极大的限制[3].筛选和改良获得优良藻株一度成为研究的热点. 利用基因工程和代谢工程，人工制造工程藻株是最简单、最直接的方法，可以快速获得理想的工程藻株以满足各种生产需求，但是需要对微藻油脂代谢和基因调控网络了解清楚.

莱茵衣藻是产油微藻重要的模式生物，基因组序列已知，蛋白质数据库完备，分子生物学和代谢方法日趋成熟[4-5]. 现代分子表达谱技术和蛋白组学的发展，也使得深入研究微藻在环境胁迫下油脂积累的细胞活动成为可能[6]. 莱茵衣藻在缺氮胁迫时，最先响应的是应激反应和碳同化过程酶，随之油脂生物合成酶的含量增加，用于积累短链的游离脂肪酸[7]. 细胞通过代谢调节适应. 莱茵衣藻油脂代谢途径已经阐明，许多关键酶基因已被克隆. 莱茵衣藻中存在着两条途径最终生成三酰甘油(triacylglycerols，TAGs)——生物柴油的主要成分，分别是Kennedy途径和PDAT途径. 二酰甘油酰基转移酶(diacylgycerol acyltransferase，DGATs)和磷脂二酰甘油酰基转移酶(phospholipids: diacylglycerol acyltransferase，PDATs)是重要的油脂合成关键限速酶[8-9]. 同时，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC)和甘油三磷酸脱氢酶(glycerol 3-phosphate dehydrogenase，G3PD)等其他碳代谢相关酶在微藻TAGs合成中也发挥着重要的作用[10-11]. 对这些关键酶基因进行调控表达时，人们发现无法同时提高微藻油脂含量和生物量[12-13].

如何同时提高油脂含量和生物量是微藻生物柴油生产面临的重要问题.微藻大多为单细胞生物，进行无性繁殖. 微藻的生物量综合取决于细胞的数目和大小，而细胞周期严格地控制着细胞的数量. 细胞周期一般分为亲代细胞物质准备和细胞分裂形成两个子代细胞两个阶段，标准的细胞周期划分为第1间隔期(G1期)、脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)合成期(S期)、第2间隔期(G2期)分裂期(M 期)4 个不同时相[14]. 细胞周期进程受到各级调控因子精确而严密的控制，包括细胞周期依赖的蛋白激酶复合物(cyclin-dependent kinase complex，CDK)、CDK的正性调控因子——细胞周期蛋白和CDK的负性调控因子——CDK的抑制剂(cyclin dependent kinase inhibitor，CKI)[15]. APC/C主要通过泛素化降解细胞周期蛋白CDK、Cyclin和CKI等，来实现对细胞周期的精细调控.APC/C是一种E3泛素连接酶复合体，由至少11个不同的蛋白亚基组成[16]，其活性受两个激活因子(CDH1和CDC20)调控. 泛素激活酶E1在ATP水解能参与下将泛素Ub激活，激活后的泛素从E1转移至与APC/C结合的泛素结合酶E2，共同特异性识别靶蛋白，对靶蛋白的赖氨酸残基进行泛素化修饰，最后形成一个包含异肽键的泛素-蛋白结合物，被26S蛋白酶体识别降解.CDC20(又称Sln1，Fzy，p55CDC)和CDH1(又称Hct1，Ste9/SRW1，FZR)既是APC/C复合物中重要的辅助因子，又是APC/C复合物特异性识别并集合底物蛋白质的关键所在[17]. 文献[18]研究表明，细胞中CDC20的表达峰值出现在G2期至M期，而CDH1的表达高峰在M期至G1期. 在微藻中这些APC/C复合物各个亚基的情况是怎么样的，目前尚处于未知状态.

本研究系统地分析了莱茵衣藻中编码APC/C复合物的基因家族，并对APC/C复合物的蛋白质特性进行分析，同时，揭示CrCDC20基因在缺氮或缺硫条件下的表达情况，为后期研究微藻细胞周期控制的分子机制奠定理论基础.

1 材料与方法

1.1 藻株及培养条件

莱茵衣藻藻株cc124购自莱茵衣藻资源中心(https://www.chlamycollection.org/).从固体平板上挑取藻株到HSM培养基中，置于恒温光照培养箱中(培养条件：25 ℃，24 h全光照，光照强度90 μE·m-2·s-1)，培养至对数生长期.

1.2 莱茵衣藻APC/C序列信息获取

莱茵衣藻基因组V5.5版本及蛋白质序列下载于植物基因组学网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html). 分析目前NCBI(national center for biotechnology information)中已登录的APC/C蛋白质的氨基酸序列，以保守性区作为种子序列，运用HMMER3.1b2软件(http://www.hmmer.org/)对莱茵衣藻蛋白质数据库进行检索，去除冗余序列，获得莱茵衣藻APC/C复合物蛋白质序列. 通过本地Blast程序，获得莱茵衣藻APC/C编码基因信息，其基因结构运用GSDS2.0软件进行分析.

1.3 莱茵衣藻APC/C蛋白质特性分析

运用ExPASy计算平台(http://www.expasy.org/)对莱茵衣藻APC/C蛋白质的相对分子质量大小(1 u=1 D)、等电点、亲疏水性和结构域等特性进行分析.通过BLASTp在NCBI数据库进行同源性搜索获得莱茵衣藻APC/C同源蛋白质，序列利用MEGA7.0软件进行ClustalW比对，采用邻接法则(Neighbour-Joining，NJ)的P-距离模型构建进化树，设定自展值为1 000.利用WoLF PSORT软件(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)对莱茵衣藻APC/C蛋白质进行定位预测.

1.4 缺氮或缺硫胁迫下CrCDC20表达谱分析

取对数生长期的莱茵衣藻细胞，按照体积比为1∶2接种，分别进行正常、缺氮或缺硫培养0、2、4、6和8 d，离心收集藻细胞，液氮速冻，用于总RNA提取，设定3个生物学重复.采用Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA. 利用Primer Premier 5.0软件设计CrCDC20定量引物. 使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Takara Bio Inc. Otsu, Japan)进行实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, rt-RT-qPCR)，分析缺氮或缺氮胁迫下不同时间内CrCDC20表达量的变化.

2 结果与分析

2.1 莱茵衣藻APC/C基因序列信息的挖掘

本研究以目前NCBI中已登录的APC/C蛋白质保守性区为种子序列，通过HMMER3.1b2软件，对莱茵衣藻蛋白质数据库进行同源性检索，去除冗余序列，最终获得13个莱茵衣藻APC/C复合物氨基酸序列，其中包含了CDC20和CDH1两个激活因子. 对莱茵衣藻APC/C复合物的编码基因进行分析发现，13个APC/C成员的长度差别很大，基因序列从1 099～20 735碱基对(base pair, bp)，编码蛋白的氨基酸数目在66～4 087不等(表1). 莱茵衣藻APC/C编码基因在13号染色体上呈基因簇出现，包含了CrAPC1、CrAPC6、CrAPC10和CrAPC11， 其他的APC/C基因分别位于第1、3、9、10、12、16和17号染色体上(表1).

表1 莱茵衣藻APC/C基因序列信息

(续表1)

2.2 莱茵衣藻APC/C基因结构

通过GSDS2.0软件分析了莱茵衣藻APC/C的基因结构(图1). 由图1可知，CrCDC20、CrAPC10和CrAPC11无内含子，CrCDC28和CrAPC13分别含有3个和1个内含子，其余的莱茵衣藻APC/C基因都具有超过10个以上的内含子. 此外，莱茵衣藻APC/C基因均含有长度不等的5′-或3′-非编码区(untranslated region, UTR)，说明莱茵衣藻的APC/C基因编码方式较为复杂.

2.3 莱茵衣藻APC/C蛋白质特性分析

采用Expasy分析莱茵衣藻APC/C蛋白质的相对分子质量大小、等电点和亲疏水性，如表2，表2结果显示，CrAPC/C蛋白质具有极强的亲水性，均为亲水性蛋白质.CrAPC/C的相对分子质量大小很不一致，范围在7.37～390.41 kD，等电点范围在4.34～9.02.

图1 莱茵衣藻APC/C基因结构组成Fig.1 The structures of APC/C genes in C. reinhardtii

蛋白相对分子质量/kD等电点蛋白相对分子质量/kD等电点蛋白相对分子质量/kD等电点蛋白相对分子质量/kD等电点CrCDC2050．508．54CrAPC2142．075．91CrAPC5103．995．97CrAPC1016．576．18CrCDH145．989．02CrAPC3108．667．70CrAPC690．215．71CrAPC119．926．25CrCDC28103．598．06CrAPC4103．324．78CrAPC885．335．89CrAPC137．374．34CrAPC1390．418．70

对莱茵衣藻APC/C蛋白质的保守结构域进行分析(图2)，发现CrCDC20和CrCDH1具有7个WD40重复基序；CrAPC3、CrAPC6和CrAPC8包含多个34肽重复序列基序(tetratricopeptide repeat，TPR)；CrAPC2和CrAPC10含有APC复合物特定的结构域，其中，CrAPC2包含的APC2结构域与cullin结构域十分类似；APC11含有一个RING结构域；这些结构域可能是莱茵衣藻APC/C复合物生物活性的关键中心.WoLF PSORT软件预测所有的莱茵衣藻APC/C蛋白质都定位于细胞核中，参与细胞周期控制.

图2 莱茵衣藻APC/C蛋白质的结构域Fig.2 Domain of APC/C proteins in C. reinhardtii

2.4 莱茵衣藻APC/C进化树分析

通过构建系统进化树分析莱茵衣藻(Chlamydomanosreinhardtii，Cr)APC/C蛋白质和模式生物拟南芥(Arabidopisisthaliana，At)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae，Sc)、裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe972h，Sp)、大豆(Glycinemax，Gm)、人(Homosapiens，Hs)、斑马鱼(Daniorerio，Dr)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans，Ce)、小鼠(Musmusculus，Mm)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster，Dm:)、盘基网柄(Dictyosteliumdiscoideum，Dd)和杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani，Ld)来源的APC/C蛋白质的进化关系. 由图3可以看出，除了CDH1和CDC20与其他物种具有较高保守性外，莱茵衣藻APC/C蛋白质具有独特性，CrAPC1、CrAPC3、CrAPC4、CrAPC5、CrAPC6、CrAPC10和CrAPC13聚为一类. CrAPC2与动物来源APC蛋白质亲缘关系更近，而CrAPC8和CrCDC28与植物来源APC蛋白质相似度更高.

图3 莱茵衣藻APC/C蛋白质的进化树Fig.3 Phylogenetic tree of CrAPC/C proteins

2.5 莱茵衣藻CrCDC20基因表达谱分析

缺氮或缺硫培养是常用的诱导莱茵衣藻积累油脂的胁迫条件. CDC20是真核生物APC/C复合物的核心亚基. 为了阐述CrCDC20在缺氮或缺硫胁迫下的表达规律，本研究分别提取了缺氮或缺硫0、2、4、6和8 d的总RNA，反转录成cDNA，进行了rt-RT-qPCR. 结果显示，CrCDC20在缺氮培养时呈下调表达，在第8天表达量最低，下调了79.7%；缺硫胁迫诱导CrCDC20上调表达，在缺硫第4天出现了高峰值，上调了4.5倍(图4). 由图4可见，缺硫胁迫诱导CrCDC20表达，缺氮时CrCDC20表达受到抑制.

图4 缺氮或缺硫胁迫时CrCDC20基因表达谱Fig.4 The expression profiles of CrCDC20 under nitrogen or sulfur deficiency condition

3 讨 论

本研究系统比较分析了莱茵衣藻APC/C蛋白质以及编码基因的结构与分子特征，为以后研究细胞周期调控的APC/C目的基因和蛋白质提供了方便. 莱茵衣藻APC/C基因家族共有13个成员，其中，包含两个激活因子CrCDC20和CrCDH1(表1). APC/C蛋白质复合体是细胞周期控制的重要调控元件，一般由11个以上的APC蛋白质和2个激活因子组成.高等动物中APC2和APC11是APC/C复合体的主要骨架和基本组成，仅有APC2和APC11即可完成APC/C复合体的泛素化降解作用[16]. 动物来源的APC2蛋白质含有cullin结构域而APC11具有一个RING-H2结构域，本研究发现莱茵衣藻APC2和APC11具有类似的结构域(图2)，且莱茵衣藻APC2与动物的APC2蛋白质同源性更高(图3)，可能莱茵衣藻APC/C复合体与动物中的APC/C复合体作用方式相似.

光合微藻可以通过交替的光-暗周期实现同步化培养[19]. 莱茵衣藻在一个光-暗周期内可以通过有丝分裂从一个母细胞产生2～32个子细胞．藻细胞在G1期进行增长，体积增大数倍，再经历n次有丝分裂期，产生2n子细胞. 细胞分裂的次数取决母细胞的大小，同时受到光照强度、营养供给和温度的调节[20]. 藻细胞中油脂的合成同样受到细胞周期的调控，细胞质和质体膜中的油脂合成发生在光阶段的早期，在之后的细胞周期中维持着一个较稳定的水平；TAG的积累模式与膜脂不同，在光阶段的2 h内急速合成，在2～8 h内出现一个降解峰，随后又逐渐合成，直到进入G0期(16 h)，又出现降解，呈现一种明显的周期变化[21].

缺氮或缺硫胁迫是常见的莱茵衣藻产油诱导条件. 缺氮下莱茵衣藻的油脂含量可以比在完全培养基(Sueoka’s high salt medium，HSM)中提高十几倍，但是生物量的积累却不及HSM中的1/10[22]，缺硫胁迫下，莱茵衣藻油脂上升的同时生物量也在下降[23]. 本研究分析了APC/C复合物中的激活因子CrCDC20在缺氮或缺硫条件下的表达量，发现CrCDC20在缺氮或缺硫条件下基因表达正好相反，缺氮时CrCDC20表达受到抑制，而缺硫能显著诱导其表达(图4)，这可能是由于缺氮和缺硫下APC/C复合物对细胞生理活动的调控方式是不一样的.

真核细胞中APC/C复合物除了调控细胞周期，还具有多种其他的功能，如影响配子发生、激素信号转导、与双链RNA结合蛋白4(double stranded RNA binding protein 4，DRB4)结合控制RNA沉默[24-25]. 目前APC/C复合物在微藻中的研究还很少见，APC/C复合物的功能还有待进一步发现，它们参与细胞生理活动调控的分子机制尚不清楚，需要深入研究. 微藻除了生产生物柴油，由于它们还可以大量积累各种各样生物活性物质，如叶黄素、虾青素、胡萝卜素和藻蓝蛋白等，用于食品、化妆品、保健品和药品等行业[26]，研究调控细胞周期的APC/C复合物的功能，为提高微藻的生物量积累奠定基础，具有十分重要的理论和经济价值.

结 语

本研究通过生物信息学方法，对莱茵衣藻APC/C复合物的蛋白质及其编码基因进行系统比较分析，共发现了13个莱茵衣藻APC/C复合物亚基，其中，包括保守的激活因子CDC20和CDH1.发现莱茵衣藻APC/C基因在13号染色体上成簇出现，部分莱茵衣藻APC/C复合物亚基具有物种特有性.同时发现CrCDC20基因在缺氮下显著下调而在缺硫胁迫时上调，为后期研究微藻细胞周期控制的分子机制奠定了理论基础.

/

[1] RATHA S K, PRASANNA R. Bioprospecting microalgae as potential sources of “green energy”—challenges and perspectives (review)[J]. Applied Biochemistry & Microbiology, 2012, 48(2):109-125.

[2] DENG Xiaodong, FAN Xinzhao, LI Ping, et al. A photoperiod-regulating gene CONSTANS is correlated to lipid biosynthesis inChlamydomonasreinhardtii[J]. BioMed Research International, 2015(4): 715020.

[3] GHASEMI Y, RASOULAMINI S, NASERI A T, et al. Microalgae biofuel potentials (review)[J]. Applied Biochemistry & Microbiology, 2012, 48(2):150-168.

[4] MOLNAR A, BASSETT A, THUENEMANN E, et al. Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in the unicellular algaChlamydomonasreinhardtii[J]. Plant Cell, 2006, 58(5): 1121-1133.

[5] YAMANO T, IGUCHI H, FUKUZAWA H. Rapid transformation ofChlamydomonasreinhardtiiwithout cell-wall removal[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering, 2013, 115(6): 691-694.

[6] LÜ Hexin, QU Ge, QI Xizhen, et al. Transcriptome analysis ofChlamydomonasreinhardtiiduring the process of lipid accumulation[J]. Genomics, 2013, 101(4): 229-237.

[7] MILLER R, WU Guangxi, DESHPANDE R R, et al. Changes in transcript abundance inChlamydomonasreinhardtiifollowing nitrogen deprivation predict diversion of metabolism[J]. Plant Physiology, 2010, 154(4): 1737-1752.

[8] OUYANG Longling, LI Hui, YAN Xiaojun, et al. Site-directed mutagenesis from Arg195 to His of a microalgal putatively chloroplastidial glycerol-3-phosphate acyltransferase causes an increase in phospholipid levels in yeast[J]. Frontiers in Plant Science, 2016: 7. doi: https://doi.org/10.3389/fpls.2016.00286.

[9] YOON K, HAN Danxiang, LI Yantao, et al. Phospholipid:diacylglycerol acyltransferase is a multifunctional enzyme involved in membrane lipid turnover and degradation while synthesizing triacylglycerol in the unicellular green microalgaChlamydomonasreinhardtii[J]. Plant Cell, 2012, 24(9): 3708-3724.

[10] TAN K W, LEE Y K. Expression of the heterologousDunaliellatertiolectafatty acyl-ACP thioesterase leads to increased lipid production inChlamydomonasreinhardtii[J]. Journal of Biotechnology, 2017, 247:60-67.

[11] DRIVER T, TRIVEDI D K, MCINTOSH O A, et al. Two glycerol-3-phosphate dehydrogenases fromChlamydomonashave distinct roles in lipid metabolism[J]. Plant Physiology, 2017, 174(4):2083-2097.

[12] IWAI M, IKEDA K, SHIMOJIMA M, et al. Enhancement of extraplastidic oil synthesis inChlamydomonasreinhardtiiusing a type-2 diacylglycerol acyltransferase with a phosphorus starvation-inducible promoter[J]. Plant Biotechnology Journal, 2014, 12(6): 808-819.

[13] KAO P H, NG I S. CRISPRi mediated phosphoenolpyruvate carboxylase regulation to enhance the production of lipid inChlamydomonasreinhardtii[J]. Bioresource Technology, 2017, 245(Pt B):1527-1537.

[14] 翟中和, 王喜忠, 丁明孝. 细胞生物学[M].4版.北京:高等教育出版社, 2011: 358-371.

ZHAI Zhonghe, WANG Xizhong, DING Mingxiao. Cell Biology[M]. 4th edition. Beijing: Higher Education Press, 2011: 358-371.(in Chinese)

[15] ACQUAVIVA C, HERZOG F, KRAFT C, et al. The anaphase promoting complex/cyclosome is recruited to centromeres by the spindle assembly checkpoint[J]. Nature Cell Biology, 2004, 6(9):892-898.

[16] TANG Z Y, LI B, BHARADWAJ R, et al. APC2 Cullin protein and APC11 RING protein comprise the minimal ubiquitin ligase module of the anaphase-promoting complex[J]. Molecular Biology of the Cell, 2001, 12(12):3839-3851.

[17] VISINTIN R, PRINZ S, AMON A. CDC20 and CDH1: a family of substrate-specific activators of APC-dependent proteolysis[J]. Science, 1997, 278(5337): 460-463.

[18] MORRIS M C, KAISER P, RUDYAK S, et al. Cks1-dependent proteasome recruitment and activation of CDC20 transcription in budding yeast[J]. Nature 2003, 423: 1009-1013.

[20] CROSS F R, UMEN J G. TheChlamydomonascell cycle[J]. Plant Journal, 2015, 82(3):370-392.

[21] JÜPPNER J, MUBEEN U, LEISSE A, et al. Dynamics of lipids and metabolites during the cell cycle ofChlamydomonasreinhardtii[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 2017, 92: 331-343.

[22] DENG Xiaodong, FEI Xiaowen, LI Yajun. The effects of nutritional restriction on neutral lipid accumulation inChlamydomonasandChlorella[J]. African Journal of Microbiology Research, 2011, 5(3):260-270.

[23] CAKMAK T, ANGUN P, OZKAN A D, et al. Nitrogen and sulfur deprivation differentiate lipid accumulation targets ofChlamydomonasreinhardtii[J]. Bioengineered Bugs, 2012, 3(6):343-346.

[24] MARROCCO K, CRIQUI M C, ZERVUDACKI J, et al. APC/C-mediated degradation of dsRNA-binding protein 4 (DRB4) involved in RNA silencing[J]. PLOS One, 2012, 7(4):e35173.

[25] HEYMAN J, VEYLDER L D. The anaphase-promoting complex/cyclosome in control of plant development[J]. Molecular Plant, 2012, 5(6): 1182-1194.

[26] LEMOINE Y, SCHOEFS B. Secondary ketocarotenoid astaxanthin biosynthesis in algae: a multifunctional response to stress[J]. Photosynthesis Research, 2010, 106(1/2):155-177.