柚皮苷与顺铂联用对骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响

裴 祎，张晓晶，郑 珂，王 巍，邱恩铎，李盛龙

0 引言

骨肉瘤是青少年中最常见的原发恶性骨肿瘤，虽然发病率较低，但是由于其恶性程度高，预后差，多发于青少年，往往会给家庭和社会带来极大的负担。放化疗技术未成熟时，对骨肉瘤的治疗多采取高位截肢或者关节离断术，不过仍有80%左右的患者由于肺转移的原因导致生存期极短[1]。随着各种新型辅助化疗药物的推广，各种化疗手段的应用，骨肉瘤的5年生存率显著提高(60%～80%)。

阿霉素、甲氨蝶呤、顺铂和异环磷酰胺是目前最常见的骨肉瘤化疗药物。单个药物治疗骨肉瘤的效率不高，通常采用药物联用的方式，但是由于化疗药物本身的毒副作用，接受化疗的患者生存质量往往较差，所以，有必要寻找新的药物来与化疗药物联合应用，以期降低化疗药物的使用浓度[2-5]。

柚皮苷(Naringin)属于黄酮类化合物，是芸香科植物中提取的单体，其广泛存在于柠檬、葡萄汁和橘子等植物中。柚皮苷具有较强的清除自由基、抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗炎和细胞保护作用，且可以抑制多种肿瘤的发生发展，但是在骨肉瘤中报道较少[6-8]。

本研究以人骨肉瘤细胞系MG63为研究对象，观察柚皮苷联合顺铂对MG63细胞增殖和侵袭转移的抑制效果，对其作用机制进行初步探索，为临床优化骨肉瘤的治疗方案提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人骨肉瘤细胞株MG63(实验室冻存)，1640培养基(Invitrogen，美国)，胎牛血清(天津灏洋，天津)，柚皮苷(Selleck，美国)，顺铂注射液(贵州汉方制药有限公司，贵州)，四甲基偶氮唑蓝MTT(碧云天，上海)，0.4 %台盼蓝(碧云天，上海)，抗体：cyclin d1、MMP2、GAPDH、二抗(Santa，美国)。

1.2 方法 细胞培养：将MG63细胞株用含10%胎牛血清的1640培养基(含50 IU/mL青霉素，50 IU/mL 链霉素)培养，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养至对数生长期。

药物处理浓度顺铂为临床常用的化疗药物，根据体表面积计算公式S=1.15+(m-30)0.1/5 (其中m>30 kg)计算出MTT所需药物浓度，顺铂取中(1×PPC)浓度。参照参考文献，柚皮苷取20 μg/mL浓度。空白对照组为NaCl处理组。

MTT实验：取对数生长期MG63细胞，以2×104/mL浓度接种于96孔培养板中，终体积200 μL，细胞培养12 h贴壁后更换培养基，加入不同浓度药物，各剂量组及对照组(NaCl处理组)分别设3个复孔。处理后的细胞于0、12、24、36、48 h分别加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃湿润环境中温育4 h，弃去孔中的培养基和MTT，在孔中各加入200 μL DMSO，以溶解残留的MTT-甲臜结晶，置回37 ℃、5%CO2细胞培养箱中。15 min后，立即在490 nm处记录吸光值。药物对细胞的抑制率计算公式为：抑制率=1-(剂量组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。

Transwell实验：以1×105每孔的密度将细胞

接种于上室中，下室添加600 μL双无培养基，12 h后添加不同处理因素。药物作用24 h后，95%乙醇固定，0.4 %台盼蓝染色。200倍显微镜下观察。

Western blot实验：RIPA裂解药物处理24 h后的细胞，取40 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳(80～130 V)，转膜(100 V，1 h)，5%脱脂奶粉封闭1 h后，一抗4 ℃过夜，二抗室温1 h，洗膜发光。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，数据比较采用非配对t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同处理因素对MG63细胞增殖的影响 分别采用5 μg/mL顺铂、20 μg/mL柚皮苷和5 μg/mL 顺铂+20 μg/mL柚皮苷联合作用于MG63细胞上，随后于不同时间点观察药物对细胞增殖的调节作用。结果显示，柚皮苷能够显著提高顺铂对MG63细胞增殖的抑制作用。各组结果与对照组之间比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.2 不同处理组对MG63细胞周期蛋白的影响 如图1所示，不同药物处理时，顺铂和柚皮苷均可以在一定程度上抑制细胞周期相关蛋白cyclin d1，二者协同作用时，抑制作用更为明显。

2.3 不同处理因素对MG63细胞迁移的影响 见图2。分别采用5 μg/mL顺铂、20 μg/mL柚皮苷和5 μg/mL 顺铂+20 μg/mL柚皮苷联合作用于MG63细胞上，随后于不同时间点观察药物对细胞迁移的作用。结果显示，柚皮苷能够显著提高顺铂对MG63细胞迁移的抑制作用。

图1 不同药物作用下细胞周期蛋白的变化

表1 顺铂、柚皮苷单独使用以及联合应用时对细胞增殖的抑制作用(%)

注：*与顺铂组比较，P<0.01；#与柚皮苷组比较，P<0.01

图2 不同药物作用下细胞迁移的变化

2.4 不同处理因素对MG63细胞迁移相关蛋白的影响 如图3所示，不同药物处理时，顺铂和柚皮苷均可以在一定程度上抑制细胞周期相关蛋白MMP2，二者协同作用时，抑制作用更为明显。

图3 不同药物作用下细胞侵袭相关蛋白的变化

3 讨论

骨肉瘤恶性程度很高，约有1/5的骨性肿瘤为骨肉瘤，好发于长骨的干骺端。股骨远端、胫骨近端和肱骨近端尤其好发。约有近4/5的病例在确诊骨肉瘤的时候已经有肺部微小转移灶，肺转移是骨肉瘤患者死亡的主要原因。近年来，随着各种化疗技术和小分子药物等不断研发，骨肉瘤患者的生存期也有所延长[9-15]。虽然化疗药物在很大程度上提高了骨肉瘤患者的生存率，但是由于骨肉瘤容易产生耐药性，手术后的长期生存率仍然不高，并且顺铂等化疗药物具有很强的毒副作用，患者可能出现较为严重的消化道反应。因此，有必要寻找新的有效的药物，配合或者取代化疗药物的使用，来提高骨肉瘤患者的生存质量。许多天然药物提取物能够对肿瘤起到治疗作用，但是效果较差，可配合化疗药物使用。有报道，柚皮苷对乳腺癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤等多种肿瘤细胞的生长有抑制作用[16-17]，其机制如下：通过影响Caspase-3的活性来调节HL-60的增殖与凋亡；通过调节黄曲霉素B参与肿瘤发生发展的调节；通过抑制PI3K/AKT通路的过度激活来抑制肿瘤的生物学功能，并且通过调节PI3K/AKT通路来提高肿瘤细胞对化疗药物的耐受性；通过调节TGF-β通路来影响肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭转移。

本研究通过将柚皮苷与骨肉瘤治疗的常见药物顺铂联合应用，检测柚皮苷对骨肉瘤细胞增殖和迁移的调节作用。MTT和Transwell结果指出，顺铂可以显著抑制骨肉瘤细胞MG63的增殖和迁移，并且Western blot实验也发现顺铂对常见的细胞周期调控蛋白cyclin d1和侵袭转移相关蛋白MMP2有一定的抑制作用。本实验结果表明，柚皮苷可以通过抑制cyclin d1和MMP2来实现对MG63细胞增殖和迁移的抑制作用。二者联合应用对MG63细胞的抑制作用显著增强，其效果优于二者单独应用，说明柚皮苷和顺铂联合应用可以起到协同作用。

综上所述，柚皮苷与顺铂联合应用，可以降低顺铂治疗骨肉瘤的使用浓度，进而减少顺铂化疗的毒副作用，对提高胶质瘤的治疗效果有一定的意义。同时柚皮苷是一种极具优势和潜力的化疗辅助药物。

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