UPLC-Q-TOFMSE技术结合UNIFI数据库快速分析桑黄化学成分

赵天一，王振洲，张楠淇，宿晓云，刘金平，李平亚，王翠竹※

（1.吉林省蒲川生物医药有限公司，长春 130012；2.吉林大学药学院，长春 130021）

桑黄（Phellinus igniarius）属担子菌亚门多孔菌目针层孔菌属真菌，为我国传统真菌类中药，味甘、辛，用于治疗血崩、血淋、带下、闭经、脾虚泄泻、脱肛泻血等[1]。研究表明，桑黄中包含多种结构类型的化学成分，包括多糖、黄酮、三萜类、芳香酸、氨基酸等，其中多糖类成分是含量最多的成分[2]。现代药理学实验也表明，桑黄具有多种药理学活性，包括抗癌、免疫调节、抗肥胖、抗氧化和抗炎等。目前，针对桑黄化学成分的研究，仍以传统的提取、分离、纯化为主，费时费力，缺乏整体研究。而且，一直以来对桑黄多糖的药理作用研究比较多，但是对桑黄子实体中小分子化合物的研究报道相对较少。因此，对桑黄进行全成分鉴定及更加深入的化学成分和药理作用研究有重要的理论和实际意义。

近年来，超高效液相色谱与飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-MSE）已经成为天然药物中活性成分快速分离和鉴定的有力手段。UNIFI是一个简单、高效、全面的平台，数据库中包括目前在600多味中药中已发现的6000多种化合物信息，能够将数据采集、峰提取、分子式确定、数据库检索及报告生成相结合，对化学成分进行快速、全面地定性分析。将UPLC-QTOF-MSE与UNIFI平台相结合，已经被应用到传统中药及复方中化学成分的快速鉴定中[3～7]。本实验采用UPLC-Q-TOF-MSE结合UNIFI平台，对桑黄的化学成分进行快速、全面地筛查分析，可为其药效物质基础阐明、全面质量控制提供依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

XevoG2-XSQTOF四级杆飞行时间质谱仪、ACQUITY超高效液相色谱二元泵和样品管理器、Masslynx V4.1工作站、UNIFI1.7.0科学信息学系统（美国Waters公司）；N-A35型氮气发生器（上海金浪科技有限公司）；FA1104N型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；R201D型恒温水浴锅、旋转蒸发器（上海豫康科教仪器设备有限公司）；TGL-16aR型飞鸽超离速离心机（上海安亭科学仪器厂）。

UPLC-MS级乙腈（美国Fisher公司）；甲酸钠、亮氨酸-脑啡肽（美国Sigma公司）；质谱用水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

桑黄由吉林省蒲川生物医药有限公司提供，经吉林大学药学院李平亚教授鉴定为桑黄（P.igniarius）。

1.2 样品溶液的制备

将干燥的桑黄子实体粉碎，研磨，过40目筛。取1g桑黄粉末，用70%甲醇在80℃水浴中提取3次，每次3h。过滤后，将滤液合并，旋干。用1.0mL 80%甲醇将提取物溶解，0.22µm滤膜过滤，取滤液备用。

1.3 UPLC-QTOF检测条件

1.3.1 色谱条件 ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱（100mm 2.1mm，1.7m），柱温30℃，样品管理器温度15℃，进样体积10L，流速0.4mL/min，流动相A：0.1%甲酸-水（v∶v）；流动相B：0.1%甲酸-乙腈（v∶v）。梯度洗脱条件：0min～2min，10%B；2min～26min，10%～90%B；26min～28min，90%B；28min～29min，90%～10%B；29min～30min，10%B。

1.3.2 质谱条件 电喷雾离子化源（ESI），MSEcontinuum模式，采用正离子及负离子检测模式。全扫描范围m/z100～1500。毛细管电压3.0kV，锥孔电压40V，锥孔气流量50L/h，脱溶剂氮气流量600L/h，氩气流量0.15mL/min，源温120℃，脱溶剂气温度300℃。采用亮氨酸-脑啡肽[M+H]+=556.277 1、[M-H]=554.262 0作为LockSpray校正标准液（100pg/mL），对仪器进行实时校正，其校正流速为正离子模式15L/min，使用甲酸钠溶液对仪器进行校正。

2 结果

采用UPLC-QTOF-MSE模式采集数据，使用UNIFI软件进行桑黄化学成分的自动识别。第1步，通过查阅文献建立桑黄数据库，作为原有的传统中药库的补充，将化合物化学结构保存成.mol格式的文件，将桑黄数据库导入到分析方法中；第2步，将原始数据通过WatersCompressionandArchivalToolv1.10软件进行压缩；第3步，UNIFI软件自动筛查、鉴定，代替传统的人工提峰、计算分子式以及分析碎片断裂情况；第4步，建立一个过滤筛选方法，设定质量误差为-5ppm～5ppm，且响应值＞4000；第5步，通过结合碎片离子理论精确质量数、相对保留时间和分子式匹配软件Elemental composition、化合物结构匹配软件MassFragment、离线和（或）在线质谱数据库（PubM-ed、Mass Bank、Chemspider、METLIN）以及相关文献对各主要化合物进行人工识别和确认。

利用UNIFI数据处理系统和MassLynx4.1软件对桑黄提取物进行定性分析，正离子、负离子模式下的质谱基峰离子流图（BPI）（图1）。在桑黄中检测到59个化合物，包括11个有机酸及有机酸酯、7个苯丙素类、7个甾体、6个三萜、5个黄酮、4个二萜、5个酚类。见表1。

图1 桑黄提取物在正离子模式、负离子模式下的基峰离子流（BPI）图Fig.1 Therepresentativebasepeakintensity(BPI)chromatograms of P.igniarius in positive and negative modes

表1 桑黄提取物化学成分的UPLC-QTOF-MSE鉴定结果Tab.1 Compounds identified from P.igniarius by UPLC-QTOF-MS/MS

续表1

续表1

3 讨论

在本研究中，首次运用UPLC-Q-TOF-MSE技术，结合UNIFI数据分析平台，定性分析了桑黄中的化学成分。在之前的研究中[8，9]，鉴于在负离子模式下质谱响应更强，有人选择在单一的负离子模式下进行。但是研究发现，不同类型化合物在不同模式下有不同强度的响应值，有些化合物只在单一模式下可以被检测出来。所以，为了更全面地推测样品中的化合物，本研究采用了正、负离子2种质谱扫描模式。

UPLC能够进行高效地分离，Q-TOF-MSE具有高灵敏度、高分辨率，能够进行精准检测，UNIFI能够进行快速筛查鉴定，将三者结合，即可实现快速地分离、检测、鉴定。Q-TOF-MS的MSE模式获得数据，可通过低碰撞能扫描和高碰撞能扫描之间快速切换同时完成2种扫描功能的数据采集[10]。排除假阳性结果，同时进行母离子、子离子和中性缺失分析。低能碰撞扫描一般都是6V，能量足够低，母离子不会断裂，保留母离子信息；高能碰撞扫描一般在15V～40V呈线性变化，导致产生碎片信息。低能碰撞和高能碰撞获得的信息再通过保留时间进行关联，为桑黄化学成分的定性分析提供化合物信息，实验快速鉴别。

总之，本实验采用UPLC-Q-TOF-MSE技术结合UNIFI数据分析平台对桑黄化学成分进行了快速定性分析，共鉴定了58种化学成分，包括11个有机酸及有机酸酯、7个苯丙素类、7个甾体、6个三萜、5个黄酮、4个二萜、5个酚类及其它成分，为中药材化学成分的分析提供了一种快速检测的方法，同时也为桑黄的质量控制、药效物质基础的阐明提供了科学依据。

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