牛型结核分枝杆菌ESAT-6原核表达载体的制备和蛋白纯化

谷晨晨，李海涛，朱言柱，常彤，苗利光※，刘艳环※，董昕瑜，刘爱萍

（1.中国农业科学院特产研究所，长春 130112；2.集安市畜牧兽医总站，吉林 集安 134200）

鹿结核病（DeerTuberculosis）是由牛型结核分枝杆菌引起的鹿的一种慢性、消耗性传染病，广泛流行于世界各地，严重危害着养鹿业的发展[1]。牛型结核分枝菌可感染鹿、牛、猪、人和大象等50余种哺乳动物和20多种禽类[2]。ESAT-6是牛型结核分枝杆菌的主要免疫优势抗原[3]，是牛型结核分枝杆菌感染早期分泌表达的一种蛋白。卡介苗（BacillusCalmette-Guérin，BCG）是用于防治结核病的减毒活疫苗，使用活的无毒牛型结核杆菌（Mycobacteriumbovis）制成，有足够高的免疫原性，可在一定程度上预防结核。但免疫动物后效果不稳定，动物机体接种BCG后会对皮内结核菌素反应的特异性产生严重干扰[4]，因此，用PPD皮试无法将疫苗接种与自然感染区分开来。自然感染结核病的动物血清中有ESAT-6抗体，而卡介苗缺失ESAT-6基因，不能表达该蛋白，不能产生ESAT-6抗体。因此，ESAT-6抗原能区分疫苗接种与自然感染，在牛型结核分枝杆菌导致的结核病早期诊断中有良好的应用前景。

1 材料

1.1 牛型结核分枝杆菌

从患结核病梅花鹿肺脏组织中分离出牛型结核分枝杆菌，由中国农业科学院特产研究所经济动物疫病研究室保存。

1.2 载体和菌种

载体pNC-HisE、枯草芽孢杆菌感受态细胞（TaK-aRa公司）；大肠杆菌C600、pUC载体（中国农业科学院特产研究所经济动物疫病研究室保存）。

1.3 主要仪器和试剂

移液器、紫外分光光度计、高速台式冷冻离心机（5415R、5810R）（Eppendorf公司）；生物二级安全柜（美国Labconco公司）；PCR仪、电转仪、凝胶成像仪（伯乐公司）；LA Taq聚合酶（TaKaRa公司）；限制性内切酶（EcoRI、BamHI）（NEB 公司）；EastepTM质粒小提试剂盒、EastepTM凝胶、PCR回收试剂盒、SDSPAGE凝胶配制试剂盒（上海普洛麦格公司）。

2 方法

2.1 DNA提取和扩增

2.1.1 牛型结核分枝杆菌DNA模版的制备 用细菌基因组提取试剂盒提取牛型结核分枝杆菌DNA。

2.1.2 扩增PCR 设计引物并带有相应的限制性内切酶酶切位点，PCR扩增在以下条件进行：94℃预变性10min，94℃30s，55℃1min，72℃1min，30 个循环，72℃延伸10min。PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.2 ESAT-6基因的克隆与鉴定

扩增的基因产物用胶回收试剂盒进行纯化，将纯化的ESAT-6基因克隆连接至pUC载体，得到重组质粒ESAT6-pUC，转化到大肠杆菌C600，氨苄抗性平板涂布，挑取白色单菌落，小剂量提取质粒，用PCR及酶切鉴定后，选取正确克隆。

2.3 目的片段的重组和表达载体的构建

将限制性内切酶双酶切后，回收目的基因片段，连接至载体pNC-HisE，转化到大肠杆菌C600，氨苄抗性平板涂布，挑取白色单菌落，小剂量提取质粒，用PCR及酶切鉴定后，选取正确克隆。

2.4 表达载体的鉴定

培养含有重组质粒的大肠杆菌，小剂量提取质粒，用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切，反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测。

2.5 表达载体ESAT6-pNC-HisE的转化和表达

将表达载体ESAT6-pNC-HisE转化到枯草杆菌感受态细胞，新霉素抗性平板涂布，挑取阳性克隆，小剂量提取质粒，用PCR及酶切鉴定后，选取正确克隆。将含ESAT6-pNC-HisE表达载体的阳性枯草芽孢杆菌的单菌落接种于LB培养基，37℃培养至OD600＝0.6，取菌液按1%的比例分别加入LB培养基、TM培养基和2SY培养基中，无需诱导，37℃培养64h，离心取上清，进行SDS-PAGE电泳检测。

2.6 目的蛋白的纯化

3 结果

3.1 目的基因的扩增

扩增出的ESAT-6基因片段大小与预期相符，分子量约为300bp。见图1。

图1 ESAT-6扩增PCR产物的核酸电泳Fig.1 Nucleic Acid Electrophoresis of ESAT-6 PCR production

3.2 中间载体ESAT6-pUC的酶切鉴定

筛选出的阳性质粒双酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测酶切出约3000bp和300bp的目的片段，说明得到正确的重组质粒。见图2。

图2 ESAT6-pUC的酶切鉴定Fig.2 Restriction enzyme identification of ESAT6-pUC

3.3 表达载体ESAT-6-pNC-HisE的酶切鉴定

筛选出的阳性质粒双酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测酶切出约5000和300bp的目的片段，说明得到正确的重组质粒。见图3。

图3 ESAT-6-pNC-HisE的酶切鉴定Fig.3 RestrictionenzymeidentificationofESAT-6-pNC-HisE

3.4 目的蛋白的表达

凝胶成像显示，在分子量为12ku处有明显的目的条带，说明目的蛋白在这3种培养基中均能表达，且TM培养基和2SY培养基表达产物浓度较高。见图4。

图4 目的蛋白在LB培养基、TM培养基和2SY培养基中的表达情况Fig.4 The expression of target protein in LB medium，TM medium and 2SY medium

3.5 目的蛋白的纯化

图5 KTA蛋白纯化结果曲线图Fig.5 The curves of protein purification byKTA system

图6 纯化蛋白SDS-PAGEFig.6 SDS-PAGE of purified protein

4 讨论

本研究根据GenBank上收录的牛型结核分枝杆菌ESAT-6基因序列，使用分子生物学软件设计了1对引物，用PCR的方法进行克隆，将扩增片段插入到中间载体，经PCR检测、限制性内切酶酶切鉴定和测序分析，确定得到了正确的重组质粒，并以此为基础构建原核表达载体 ESAT6-pNC-HisE。将构建的表达载体转化至枯草芽孢杆菌感受态细胞中，通过培养得到表达产物后，对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化的蛋白分子量大小为12ku，与预测的蛋白分子量大小一致，证实构建了正确的表达载体并建立了可靠的纯化方法。本实验通过枯草芽孢杆菌分泌性表达ESAT-6蛋白以及KTA系统蛋白纯化，建立了一种可快速、简便获得ESAT-6蛋白的方法，为鹿结核病的早期诊断技术的研发提供实验基础和技术支持。

[1]马广福.家畜传染病[M].北京:农业出版社，1989:17-20.

[2]Cousins DV.Mycobacterium bovis infection and control in domestic livestock[J].Reviewof Science and Technology，2001，(20):71-85

[3]Buddle BM，Wards BJ，Aldwell FE，et al.Influence of sensitisation to environmental mycobacteria on subsequent vaccination against bovine tuberculosis[J].Vaccine，2002，20(15):1126-1133

[4]肖建华，高利，易美丽，等.鹿结核病诊断与预防的研究现状[J].特产研究，2005，(3):44-46