益气养阴活血汤对糖尿病肾病大鼠肾间质纤维化及肾间质中相关因子蛋白表达的影响*

翁思颖柴可夫

1 浙江中医药大学基础医学院 浙江 杭州 310053

2 浙江省宁波市中医院 浙江 宁波 315000

糖尿病肾病(DN)是一种严重的糖尿病微血管并发症，是导致终末期肾病的重要原因之一。高糖所致的慢性炎症可引发肾间质纤维化，是DN早期肾损伤病理改变之一。在其纤维化过程中，可出现上皮细胞标志E-钙黏蛋白(E-Cadherin)丢失、间充质细胞标志α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及转化生长因子-β1(TGF-β1)增加[1-2]。本团队前期研究[3]运用益气养阴活血汤治疗DN大鼠，发现该方可下调大鼠肾组织NF-κB及MCP-1表达。为进一步探讨其保护肾脏的作用机制，本研究建立DN大鼠模型，以观察益气养阴活血汤对DN大鼠肾组织TNF-α及TGF-β1、α-SMA、E-Cadherin表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物：8周龄雄性SD大鼠54只，SPF级，体重220～240g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心。实验动物按3R原则给予人道关怀，经浙江中医药大学动物实验中心伦理委员会审核批准通过。

1.2 实验药物：益气养阴活血汤组成：生黄芪、女贞子、葛根各30g，丹参20g，制大黄5g。全方药材由浙江省中药研究所制剂室提供，全部药材粉碎后加5倍水煎煮1h/次，合并2次滤液，调整PH值至7，浓缩定容至生药含量2g/ml，微孔滤膜过滤除菌，分装后4℃保存。

1.3 主要试剂及仪器：总蛋白提取试剂盒购于Thermo，一抗兔抗大鼠TNF-α抗体、TGF-β1抗体、α-SMA抗体、E-Cadherin抗体均购于Abcam，二抗羊大鼠IgG抗体购于Thermo，脱水机(Thermo)，石蜡切片机、染色机、封片机(LEICA)，光镜(OlymPus)。

1.4 造模与分组方法：参照文献[4]建立DN大鼠模型，选取46只大鼠为造模组，禁食不禁水12h后，一次性腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ)溶液45mg/kg。选8只正常大鼠设正常对照组(NC)，腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲液。两组均予普通饲料喂养2周。2周后造模组大鼠禁食不禁水10h，筛选24只空腹血糖值在22±8mmol/L和尿总蛋白排泄率在50µg/min以上的大鼠为DN模型大鼠，随机分为3组，即模型对照组(MC)、益气养阴活血汤低剂量组(10g/kg，TD-lo)、益气养阴活血汤高剂量组(30g/kg，TD-hi)。模型对照组和正常对照组灌服10ml/kg/d生理盐水，余组灌服规定浓度中药，连续灌胃8周。

1.5 标本采集方法：每2周以血糖试纸测大鼠尾静脉空腹血糖（FBG）。给药结束后，大鼠禁食不禁水12h，取晨尿50μl留作尿液样本。大鼠心脏取血4ml后处死，剪开腹腔后快速切除双肾，去除肾包膜并冲净，将肾组织放入10%福尔马林液固定，制备切片，拟行苏木素伊红(HE)及Masson染色及免疫组化检测。

1.6 一般指标测定：生化法测大鼠血清肌酐(Scr)、血清尿素氮(SUN)水平(罗氏生化仪)，ELISA法测尿液N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性。

1.7 HE染色及Masson染色：肾组织10%甲醛固定，常规酒精脱水、石蜡包埋、切片后，取部分行HE染色，光镜下观察肾组织病理改变情况。另取部分以铁苏木素及丽春红酸性品红染液行Masson染色，光镜下观察肾组织纤维化程度。光镜下每张切片随机选取5个不重叠视野，Image.Pro Plus6.0分析系统测定胶原纤维蓝染区面积，以该区域占选定区域面积(=视野面积-空白面积)百分比来评定肾间质纤维化程度。

1.8 免疫组化法检测：大鼠肾脏切开后，肾组织经10%甲醛固定，蒸馏水冲洗后常规石蜡包埋、切片、脱蜡，并水化、高压热修复抗原，以3%H2O2封闭过氧化酶，加入一抗兔抗大鼠TNF-α多克隆抗体(PBS 1：100倍稀释)、TGF-β1多克隆抗体(PBS 1：100倍稀释)、α-SMA多克隆抗体(PBS 1：150倍稀释)、E-Cadherin多克隆抗体(PBS 1：150倍稀释)，4℃孵育过夜后，室温滴加二抗(用前PBS 1：1稀释)，37℃孵育15min，PBS冲洗后加入DAB显色(用前PBS 1：25稀释)，苏木素复染、脱水、封片。光镜下观察细胞内出现棕褐色颗粒为阳性。每张切片在高倍视野下随机选取5个不同视野，以Image.Pro Plus6.0软件对选择阳性面积进行测定计算，并取均值进行分析，测定TNF-α、TGF-β1、α-SMA、E-Cadherin蛋白表达。

1.9 统计学方法：采用SPSS23.0软件行数据分析，所有连续性变量以(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐则采取LSD检验，方差不齐则采用Dunnett’t3检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠FBG水平变化情况及给药8周后大鼠Scr、SUN水平及尿NAG水平：对大鼠FBG监测发现，与NC组比较，MC组大鼠血FBG水平上升，差异有统计学意义(P＜0.05)；与MC组比较，TD-lo组及TD-hi组的血FBG水平差异均无统计学意义(P＞0.05)。4组大鼠的血清Scr、SUN水平差异均无统计学意义(P＞0.05)。另外，与NC组比较，MC组大鼠尿NAG水平上升，差异有统计学意义(P＜0.05)；与MC组比较，TD-lo组尿NAG水平差异无统计学意义(P＞0.05)，TD-hi组尿NAG水平下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。详见图1、2。

图2 各组大鼠血清Scr、SUN、尿NAG水平变化情况(例数=8)

2.2 给药8周后大鼠肾组织病理改变：HE染色：A图(NC组)：肾小球、肾小管形态正常；B图(MC组)：肾小球系膜细胞增生，肾小管基底膜增厚，间质内较多炎症细胞浸润，散在小灶出血；C图(TD-lo组)：肾小球、肾小管病变同B组，间质炎症细胞浸润较B组少，可见部分小灶出血散布；D图(TD-hi组)：肾小球系膜细胞增生、肾小管基底膜增厚不明显，间质内炎症细胞浸润不明显，偶见散在小灶出血。详见图3。

图3 各组大鼠肾组织HE染色

Masson染色：A图(NC组)：可见肾组织无异常；B图(MC组)可见肾组织大量条索样增生，与NC组比，肾间质纤维化程度增加，差异有统计学意义(P＜0.05)；C图(TD-lo组)肾组织条索样增生与MC组类似，纤维化程度差异无统计学意义(P＞0.05)；D图(TD-hi组)肾组织中染色纤维条索样增生较MC组减轻纤维化程度减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图4、图5。

图4 各组大鼠肾组织Masson染色

图5 各组大鼠肾间质胶原纤维蓝染区面积/(视野面积-空白面积)百分比(例数=8)

2.3 免疫组化法测大鼠肾小管间质TNF-α、TGF-β1、α-SMA、E-Cadherin的蛋白表达：与NC组比较，MC组大鼠TNF-α、TGF-β1、α-SMA蛋白表达水平均升高，ECadherin蛋白表达水平下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；与MC组相比，TD-lo组TNF-α蛋白表达水平下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，TGF-β1、α-SMA、ECadherin蛋白表达水平差异均无统计学意义(P＞0.05)，TD-hi组TNF-α、TGF-β1、α-SMA蛋白表达水平均下降，E-Cadherin蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。详见图6。

图6 各组大鼠肾间质TNF-α、TGF-β1、α-SMA、ECadherin蛋白表达(像素×103，例数=8)

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病最主要的慢性并发症之一，2013年的一项流行病学调查研究显示DN患者10年发病率高达30.6%[5]。传统观念认为DN主要病理改变是肾小球硬化，而近期研究发现在早期DN肾损伤时即出现炎性因子升高并引发肾小管间质纤维化，可不依赖肾小球病变直接导致肾功能恶化[6]。肾间质纤维化形成与高血糖诱发的炎症反应有关，炎性因子可促使肾小管上皮细胞活化、淋巴细胞与巨噬细胞浸润肾间质，引发肾小管细胞过度凋亡，也可促使纤维化相关因子如转分化因子TGF释放，引起肾小管上皮细胞转分化、上皮细胞标志E-Cadherin丢失，导致肾间质纤维化形成。另外细胞外基质蛋白如α-SMA合成增多、降解减少，过度沉积于间质也可引发间质纤维化形成[7]。而早期肾小管损伤可出现尿液小分子量蛋白质与NAG升高，可作为特征性标志物评价肾小管损伤程度。

本研究结果显示，各造模组大鼠均出现血糖升高，组间无明显差异(P＞0.05)，MC组大鼠尿NAG水平较NC组升高(P＜0.05)，TD-hi组尿NAG水平较MC组下降(P＜0.05)，TD-lo组较MC组下降则无明显差异(P＞0.05)。4组大鼠血清Scr、SUN水平无明显差异(P＞0.05)。MC组大鼠肾组织切片HE染色可见肾单位受损、肾小管蛋白管型、肾间质内炎症细胞浸润、散在小灶出血，肾间质纤维化明显。Masson染色可见肾间质大量条索样增生。TD-hi组大鼠肾组织病理切片中肾小管基底膜增厚、肾间质内炎症细胞浸润及间质纤维化明显减轻，肾间质条索样增生明显减少，TD-lo组大鼠肾组织中损伤与间质纤维化减少不明显。另外，免疫组化结果示MC组大鼠较NC组出现TNF-α、TGF-β1、α-SMA蛋白表达升高，E-Cadherin蛋白表达下降(P＜0.05)；较MC组，TD-lo组TNF-α蛋白表达下降(P＜0.05)，TGF-β1、α-SMA、E-Cadherin蛋白表达均无变化((P＞0.05)，TD-hi组TNF-α、TGF-β1、α-SMA蛋白表达均下降，ECadherin蛋白表达升高(P＜0.05)。

中医学理论中糖尿病肾病是因消渴日久、耗伤阴津、炼津成瘀、入络成痹引起。益气养阴活血汤由黄芪、女贞子、葛根、丹参、制大黄组成。方中，生黄芪益气扶正，葛根生津解热，二者共为君药，女贞子养阴滋肾，丹参活血凉血，酒制大黄祛瘀之力愈强，全方共奏益气养阴、活血消癥、通利肾络之效。本研究发现益气养阴活血汤可下调DN大鼠肾组织TNF-α、TGF-β1、α-SMA表达，上调E-Cadherin表达，故笔者推断益气养阴活血汤可能通过以上机制减少高血糖引起的肾间质纤维化，从而达到缓解高血糖所致肾损伤的目的。

[1]谢盛彬,王伟铭,陈楠.UUO模型大鼠肾间质纤维化动态进展及α-SMA、TGF-β1和VDR表达变化[J].上海交通大学学报(医学版),2010,30(7)：752-757，796.

[2]张琳琪,吕雁,刘红亮,等.益肾化瘀方对单侧输尿管结扎大鼠肾组织中α-SMA、E-cadherin表达的影响[J].中华中医药杂志,2014,29(6)：1966-1969.

[3]柴可夫,吴喜喜,杜月光.糖肾颗粒对糖尿病大鼠肾脏NF-κB和MCP-1表达的影响[J].中华中医药杂志,2016,31(8)：3290-3293.

[4]陈澍,刘雪芳.链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病肾病模型的建立[J].实用医学杂志,2006,22（11）：1239-1240.

[5]Amin AP，Whaley-Connell AT，Li S，et a1.The synergistic relation shiP between estimated GFR and micro album in uria in Predicting long-term Progression to ESRDor death in Patients with diabetes：results from the Kidney Early Evaluation Program(KEEP)[J].American Journal of Kidney Diseases,2013,61(4)：S12-S23.

[6]罗俊辉,李瑛.炎症细胞与糖尿病肾病肾间质纤维化[J].中国中西医结合肾病杂志,2011,12(8)：742-745.

[7]陈腾锋.肾脏纤维化机制的研究进展[J].国际泌尿系统杂志,2011,31(3)：404-405.