非小细胞肺癌相关IncRNA的研究进展

雷鸣，罗迪贤，杨明，周媛

(1 南华大学附属常德市第一人民医院，湖南常德 415003；2 南华大学转化医学研究所)

长链非编码RNA(IncRNA)是一类转录本长度超过200个核苷酸残基的非编码RNA,其本身缺乏明显的开放阅读框，以RNA的形式在多层面调控基因的表达水平。IncRNA起初被认为是基因转录的“垃圾”或“杂音”并未受到重视[1～3]。但后来的研究发现，IncRNA的异常表达与肿瘤的形成、浸润、转移过程相关，并参与细胞分化、细胞内物质交换、核内运输以及细胞周期、染色质修饰、干细胞重组、转录激活、转录干扰等多种重要的调控过程。最近研究表明[4]，IncRNA对非小细胞肺癌(NSCLC)的侵袭性、转移能力以及增殖能力起重要的调控作用，并与患者预后及对化疗药物的耐药有密切关系。本文就近年来国内外研究发现的一些IncRNA在NSCLC中的表达紊乱、生物学功能及分子机制作一综述，旨在为NSCLC的诊断治疗、转移及耐药等方面的研究提供理论依据。

1 IncRNA概述

IncRNA定位于细胞核和细胞质，可通过表观遗传学调控、转录调控及转录后调控机制调控基因表达，参与细胞的生理过程。IncRNA根据其蛋白编码基因的位置关系分为五类，即正义、反义、双向、内含子和基因间IncRNA[5]。IncRNA在分子遗传学和细胞进程中起着重要作用，其主要功能包括：通过抑制RNA聚合酶Ⅱ招募或者诱导染色质重构来影响下游基因表达；于蛋白编码基因上游干扰比邻的蛋白编码基因表达；与蛋白编码基因转录本之间形成互补双链，干扰mRNA的剪切；抑制RNA聚合酶的活性，改变蛋白编码基因的表达；选择性剪接序列；调节蛋白亚细胞定位；是小分子 RNA(如siRNA、miRNA)的前体分子；通过与特定蛋白质结合改变蛋白质功能及调节活性。

2 IncRNA在NSCLC发生、发展中的作用及其机制

NSCLC的转移是由多个步骤协调进行的复杂过程，肿瘤转移发生期间，NSCLC细胞从原发肿瘤区逃逸而进入新器官或者组织，其迁徙和转移的关键性变化取决于上皮到间皮转移(EMT)以及肿瘤细胞的多能性(CS)。这一过程在胚胎发育以及肿瘤细胞的转移和迁徙中起着十分重要的作用[6,7]。上皮细胞的黏附功能的缺失以及获得间皮细胞的特征意味着EMT及CS产生。因此，抑制肿瘤进展的关键在于抑制肿瘤细胞的转移和侵袭，而lncRNA可促进肿瘤的发生与进展[8]。大量数据提示，IncRNA可参与多个水平调控基因的表达，影响细胞的生长和发育，并且与疾病，尤其是肿瘤的发生、发展及预后有着密切关系。研究发现，多种IncRNA在NSCLC组织及细胞系中异常表达，其通过刺激或抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡、及细胞周期等生物学过程来调控NSCLC发生发展。探索IncRNA的表达情况及其作用机制可能为NSCLC的早期筛查、分子诊断以及临床治疗提供新的思路和靶点。目前研究较为深入的与NSCLC相关的IncRNA主要有肺腺癌转移相关转录子1(MALAT1)、H19、母系表达基因3(MEG3)、HOX转录反义RNA(HOTAIR)、生长停滞特异性转录本5(GAS5)、FOXF1-AS1、HOXA11-AS。

2.1 MALAT1 MALAT1又称NEAT2，是最早发现于肺癌组织的IncRNA，其基因组定位于11q13上，全长超过8 kb。研究证实，MALAT1在很多肿瘤组织如肺癌、黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌等组织中表达上调,且与肿瘤的恶化程度密切相关[9,10]。Schmid等[11]对352例NSCLC患者的癌组织、癌旁组织进行组织芯片分析发现，MALAT1在其中123例(35%)患者的癌组织中呈高表达，且癌组织中MALAT1表达水平与淋巴结转移、细胞分化程度、肿瘤的病理分期存在一定的相关性；MALAT1表达水平高者病理分期多为晚期，肺癌组织分化程度低，淋巴结转移数目多，范围广，预后较差。提示MALAT1在NSCLC中表达具有病程和组织特异性，在有远处转移的患者肿瘤标本中MALAT1的表达水平显著上调，并与患者的TNM分期、转移等密切相关。Gutschner等[12]研究发现，用siRNA沉默MALAT-1表达可明显抑制肺癌细胞的转移，与转移相关基因HMMR的mRNA前体及成熟的mRNA表达水平均降低，提示MALAT1可调控转移相关基因。进一步研究显示，NSCLC细胞MALAT被封闭表达后，可通过转录或转录后调节机制调节与细胞侵袭、迁移相关的基因，影响着mRNA前体的稳定性及成熟mRNA的加工过程，导致成熟的mRNA表达量降低，从而调节一系列与细胞外基质和细胞骨架相关基因的表达。NSCLC中MALAT1具有癌基因的特点，能促进细胞侵袭转移，可作为NSCLC转移早期阶段和患者预后的特异性标记物。

2.2 H19 H19是一种靠近染色体11p15.5端粒区，转录子长度为2.3 kb，由母源性表达、父源性印迹癌胚基因。研究发现，H19在胚胎组织形成和发育过程中呈高表达，而在出生后的正常组织中沉默。现有的研究资料表明，lncRNA H19在许多肿瘤组织中异常表达，如肝癌、宫颈癌、膀胱癌、乳腺癌等，并发现其具有原癌活性。最新的研究显示，H19在NSCLC中表达明显升高，在肿瘤细胞增殖、侵袭和转移过程中扮演重要的角色[13]。H19表达水平与NSCLC肿瘤大小和分期呈正相关，高水平H19表达患者预后较差。进一步体外实验发现，在肺癌中利用基因敲除方法干扰H19表达后, NSCLC细胞的集落形成能力和独立贴壁能力下降，癌细胞的分化受到明显抑制，表明下调H19可逆转c-Myc对细胞的调控，提示H19可能在c-Myc下游发挥功能执行者的作用。此外，H19还可通过抑制E-钙黏蛋白的表达上调与miR-675有关的转录激活因子Slug，促进上皮细胞向间叶细胞转化，从而引起肿瘤细胞的浸润和肿瘤的转移。但也有研究发现[14]，在肾母细胞瘤、胚胎横纹肌肉瘤和伯-韦综合征中，H19作为一种抑癌基因，可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭以及肿瘤新生血管的形成。

2.3 母系表达基因3(MEG3) MEG3位于染色体14q32.3，长度约为1 700 nt，是第一个被报道具有抑癌基因功能的IncRNA。MEG3在多种正常组织中恒定表达，特别在脑组织呈现高表达。但在脑癌、鼻咽癌、膀胱癌等多种肿瘤细胞株中其表达水平降低甚至出现缺失[15]，提示MEG3异常表达可抑制体外肿瘤细胞增殖，MEG3具有肿瘤抑制因子作用。Lu等[16]采用qRT-PCR技术研究了44例NSCLC患者的癌组织及癌旁组织，发现MEG3在肿瘤组织和细胞中表达明显低于正常组织，与病理分期及肿瘤体积存在相关性。说明MEG3在NSCLC组织中也可能是一种抑癌基因。目前已有研究发现，p53是MEG3下游的一个作用靶点，P53作为转录因子，能调控多种肿瘤抑制基因如PTEN、ARF及BRCA1等的表达，是细胞内的一种非常重要的抑癌基因。一般情况下，细胞内p53蛋白水平非常低，因为泛素-蛋白酶体途径可使细胞内p53迅速降解。p53泛素酶是一种E3泛素连接酶，主要是由MDM2介导发挥其作用，MDM2的抑制作用使p53的稳定性增强，因此推测MEG3可通过下调MDM2的表达，增加P53蛋白积累，激活各种依赖p53的转录活动，从而起到抑制肿瘤发生、发展的作用。体外试验进一步利用截短体、RNA pulldown和RIP等实验验证MEG3与p53之间的直接相互作用，影响p53下游靶基因发挥功能，从而证实MEG3过度表达可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，增强p53介导的转录激活作用。

2.4 HOX转录反义RNA(HOTAIR) HOTAIR是一个定位于哺乳动物12ql3.13上HOXC位点，长度为2 158 nt的IncRNA，其包括5个短的外显子和1个长外显子，是第一个被发现通过反式转录调控基因表达的长链非编码RNA。Gupta等[17]研究发现，HOTAIR可通过与多梳蛋白抑制复合物2(PRC2)结合，导致组蛋白H3赖氨酸第27位赖氨酸甲基化，继而沉默HOXD基因座及相关抑癌基因的转录，从而促进肿瘤的侵袭和转移。Ge等[18]提出，HOTAIR通过调控Wnt通路抑制因子(WIF1)来增高胞质内β-catenin水平，并使之向核内聚集，从而促使Snail高水平表达。转录因子Snail是EMT转变过程中最重要的调控因子，可促使上皮标志物的特性消失，转而表达间质细胞的特性，诱导EMT发生。由此推测，HOTAIR可能通过调控Snail水平，参与了肿瘤细胞EMT过程并最终促进肿瘤侵袭和转移。Nakagawa等[19]研究发现，NSCLC患者癌组织、癌旁正常组织及脑转移组织中HOTAIR表达水平较正常组织明显增高，而且其表达水平与患者的细胞分化程度、远处淋巴结转移或淋巴血管浸润密切相关。Ono等[20]通过临床病理资料分析发现，NSCLC患者HOTAIR高水平表达组比HOTAIR低水平表达组的患者更易发生淋巴结转移、预后更差，生存期更短。进一步的基因分析显示，敲除HOTAIR能显著抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力，增强细胞对化疗药物的敏感性等，提示对HOTAIR在肺癌中作用机制的研究可能为寻找临床治疗中逆转肿瘤耐药新靶点提供新的思路。

2.5 生长停滞特异性转录本5(GAS5) GAS5最初是通过抑制削减杂交技术从鼠NIH3T3细胞分离出的IncRNA。GAS5是一种潜在孤立的肿瘤抑制基因，与人类T细胞凋亡有关。作为小核仁RNA(SnoRNA)5′TOP基因家族中的一员，GAS5定位于非编码蛋白染色体1q25.1的小开放阅读框，长度约630 nt，其包含12个外显子以及内含子区域的10 box C/D snoRNAs[21]。有研究发现，在通过血清饥饿诱导或者翻译抑制剂处理所致的生长停滞和细胞凋亡时，GAS5转录因子表达明显增加[21]。GAS5在T淋巴细胞的凋亡和细胞周期调控中发挥着至关重要的作用。体内外实验结果表明，过表达GAS5可以诱导肿瘤细胞凋亡和生长停滞，减弱了肿瘤细胞集落形成的能力[22]。另有研究表明，GAS5在多种肿瘤组织中表达下调，从而推测GAS5在肿瘤的发生和发展过程中扮演了抑癌基因的角色[23]。提示GAS5可调控NSCLC的发生与发展，是一个潜在的肿瘤标志物以及一个新的治疗靶点。

2.6 FOXF1-AS1 FOXF1-AS1作为一种可能的癌症抑制因子，又被称为FENDRR，在胃癌组织中的表达下降，并与其预后相关。而肺癌组织中IncRNA FOXF1-AS1的表达与正常组织相比也有明显下调，且FOXF1-AS1的缺失可以出现在NSCLC的所有类型和阶段中。Miao等[24]研究发现，在NSCLC中IncRNA FOXF1-AS1低表达。在肿瘤细胞中与肿瘤转移最重要两个蛋白是E-钙黏素和波形蛋白，而在肿瘤细胞中稳定过表达的IncRNA FOXF1-AS1可下调这两种蛋白的表达，从而调控EMT，抑制肿瘤的发生、发展。另外，过表达的IncRNA FOXF1-AS1可抑制肿瘤细胞茎环样结构的形成，从而抑制肿瘤细胞的EMT与转移。FOXF1-AS与PRC2蛋白的亚结构EZH2紧密连接，而EZH2在肿瘤细胞高表达是肿瘤转移的一个重要成分，基因敲除FOXF1-AS1则促进肿瘤细胞的增殖与迁移。在NSCLC中IncRNA FOXF1-AS1表达下调与FOXF1蛋白表达下调有关，低表达FOXF1-AS1有利于肿瘤的迁移与EMT。因此通过上调IncRNA FOXF1-AS1表达可能为治疗NSCLC潜在的药物靶点

2.7 HOXA11-AS HOXA11-AS与上皮性卵巢癌、胶质瘤、胃癌、结直肠癌以及肺腺癌发生有关。有研究表明，IncRNA HOXA11-AS在NSCLC组织以及肿瘤细胞A549和H1299中高表达，在肿瘤细胞中通过基因敲除IncRNA HOXA11-AS可抑制肿瘤细胞的侵袭力，同时也抑制了肿瘤细胞的EMT过程[25]。敲除IncRNA HOXA11-AS后，与EMT过程进展有关的蛋白ZEB1、ZEB2、Snail1、Snai2、N-cadherin在肿瘤细胞A549和H1299中低表达，而E-cadherin表达上调。IncRNA HOXA11-AS在肿瘤细胞A549和H1299细胞核和部分细胞质区域高表达。miR-200b靶向下调EZH2基因，抑制肿瘤细胞的EMT过程，另外EZH2和DNMT基因可结合miR-200b基因启动子区域，IncRNA HOXA11-AS可与EZH2和DNMT基因相互作用抑制miR-200b表达，促进肿瘤的EMT发生。因此下调IncRNA HOXA11-AS表达可能为治疗NSCLC的一个关键靶点。

2.8 AGAP2-AS1 AGAP2-AS1是由位于12q14.1位置的长度约1 567个核苷酸的基因转录而来。研究发现，AGAP2-AS1在胃癌组织及细胞株中高表达，且AGAP2-AS1高表达的NSCLC患者的预后较差。有研究表明，体外实验中敲除AGAP2-AS1能抑制胶质瘤细胞的增殖，迁徙和侵袭，同时提高肿瘤细胞的凋亡率[26]，且AGAP2-AS1在NSCLC患者肿瘤组织高表达，AGAP2-AS1通过下调基因LATS2表达从而抑制NSCLC细胞的增殖。Fan等[27]研究发现，在NSCLC患者中AGAP2-19与肿瘤的分期和淋巴结转移密切相关，这意味着AGAP2-19功能可能是一种肿瘤启动因子。临床生存分析AGAP2-AS1高表达与NSCLC患者预后较差有关。因此，AGAP2-AS1表达检测有助于NSCLC的诊断及预后判断。

3 总结与展望

IncRNA是一组非编码蛋白质的RNA，具有多种生物学活性。多方面数据已经证实，IncRNA可以影响细胞凋亡、信号通路和肿瘤转移及浸润等过程，其水平的表达异常与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等生物学行为密切相关。随着新一代高通量测序技术，生物芯片技术的成熟以及对于肿瘤的研究进一步渗透，IncRNA的功能及作用机制越来越显得清晰。IncRNA可用作非侵袭性筛查，现已有多个研究发现，IncRNA与NSCLC发生和发展密切相关，可能成为NSCLC早期诊断的分子诊断标志物，并成为治疗NSCLC的药物作用以及监测预后的一个潜在靶点。然而由于IncRNA本身作用方式的多样性及不确定性，其对NSCLC具体的调控分子机制仍停留在未知阶段，有待进一步探索。目前研究面临的困难仍较多，如研究的手段较少、缺少高质量的数据库等。另外，一些重要的InRNA在体内表达水平较低，也增大了研究的难度。

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