蝙蝠葛酚性碱灌胃对大鼠脑缺血再灌注损伤的预防作用及其机制

冉丰，曾晓莉，张文娟，王妍,何治

(1三峡大学医学院，湖北宜昌443002；2三峡大学附属仁和医院；3 湖北三峡职业技术学院医学院；4佛山市第一人民医院)

随着人口老龄化日益严重,脑血管疾病发病率日趋增高，尤以缺血性脑血管病最常见[1～3]。我国植物资源丰富,从传统中草药中寻找治疗缺血性脑血管疾病的药物是一条可以探索的道路。蝙蝠葛又名北豆根，其根茎可用于治疗心血管疾病和血栓栓塞。蝙幅葛酚性碱(PAMD)是从蝙蝠葛根茎中提取的一种混合物,包含多种脂溶性生物碱，其主要成分是蝙蝠葛碱(Dau)和蝙蝠葛苏林碱(Ds)，均为双苄基异喹啉类生物碱，脂溶性高，易透过血脑屏障[4,5]。PAMD能预防家兔脑缺血导致的神经损伤[6,7]，但其具体作用机制不清楚。N-甲基-D-门冬氨酸受体(NMDAR)介导的兴奋性神经毒性是脑缺血再灌注损伤的核心机制。2016年7～10月，本研究观察了PAMD灌胃对大鼠脑缺血再灌注损伤的预防作用，现分析结果并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级雄性SD大鼠36只,体质量250～300 g,由三峡大学实验动物中心提供(实验动物合格证号4210200047)。PAMD为淡黄色粉末，纯度>95%，由中国科学院昆明植物研究所潘锡平博士提供，用1 mol/L稀盐酸溶解后，用1 mol/L NaOH调pH至6.4，过滤除菌后4 ℃保存。2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)购自Sigma公司，批号为20100610。GAPDH一抗(兔抗鼠)购自Santa Cruz 公司，批号为sc-25778，规格为1 mL。NMDAR2B一抗(兔抗鼠)购自CST公司，批号为4212，规格为100 μL。Phospho NMDAR2B一抗(兔抗鼠)购自CST公司，批号为4208，规格为100 μL。二抗(羊抗兔)购自Santa Cruz公司，批号为sc-2030，规格为500 μL。水合氯醛购自天津科密欧化学试剂有限公司；BCA蛋白定量试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司。

1.2 脑缺血再灌注损伤模型制作及分组干预 将36只大鼠随机分为假手术组、模型组、PAMD组，每组12只。PAMD组先每日给予50 mg/kg的PAMD灌胃1周，假手术组和模型组分别给等体积生理盐水。PAMD组和模型组采用大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血模型。大鼠禁食12 h，自由饮水。用10% 水合氯醛以0.35 mL/100 g的剂量腹腔注射麻醉，仰卧位固定，颈部去毛备皮，碘伏、乙醇消毒。取颈正中线切口，钝性分离右侧颈动脉鞘；分离出光滑的颈总、颈内和颈外动脉，结扎右侧颈总及颈外动脉，于颈总动脉下预留缝合线用于之后固定栓线。夹闭颈总动脉，用眼科剪在距离颈外、颈内动脉分叉0.5 cm处的颈总动脉上开一小口，从开口处往颈内动脉慢慢插入直径0.235或0.265 mm的尼龙栓线，松开夹子，将栓线插入2.5 cm左右可达到1.8～2.0 cm的插入深度，用预留线固定插入的尼龙栓线。缝合消毒后将大鼠放回笼内。持续栓塞2 h后拔出栓线，再灌注4 h。动物苏醒后出现对侧肢体运动障碍及血管栓塞的同侧Hornor征，证实造模成功。假手术组操作过程同手术组，但不结扎右侧颈总和颈外动脉，也不插入栓线。术中保持动物肛温在 (37±0.5) ℃。

1.3 各组神经功能损伤评分 造模3 h，采用Longa Zea的6级评分法对各组行神经功能损伤评分：无神经损伤症状计0分；不能完全伸展栓塞对侧前爪计1分；向栓塞对侧转圈计2分；向栓塞对侧倾倒计3分；不能自发行走、昏迷计4分；死亡计5分。

1.4 各组缺血再灌注侧脑梗死情况观察 神经功能损伤评分结束后各组取3只大鼠麻醉后断头取脑，从大脑视交叉处平行于冠状面切成2 mm厚的脑片，浸入用0.2 mol/L的 PBS配制的2% TTC染色液中，避光染色6～15 min，取出脑片放整齐并拍照保存。采用ImageJ图像分析软件计算每张染色图片中脑梗死面积(白色区域为梗死脑组织，红色区域为正常脑组织)。脑片厚度与各脑片梗死面积之和相乘即为脑梗死体积。脑梗死体积 (%)=梗死区体积/(梗死区体积+非梗死区体积)×100%。

1.5 各组缺血再灌注脑皮层组织NR2B和p-NR2B检测 采用Western blotting法。取各组缺血再灌注脑皮层组织，提取总蛋白，蛋白湿转入硝酸纤维膜上，经5%牛奶封闭30 min，4% BSA封闭5 min。加入兔源NR2B、p-NR2B一抗，4 ℃孵育18 h，0.02 mol/L TBS洗膜10 min×3次，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，37 ℃孵育1 h，0.02 mol/L TBS洗膜10 min×3次，ECL显色曝光。以GAPDH为内参照， NR2B、p-NR2B相对表达量以NR2B和p-NR2B条带与GAPDH条带灰度值之比表示。

2 结果

2.1 各组神经功能损伤评分比较 PAMD组、模型组、假手术组神经功能损伤评分分别为(0.84±0.26 )、(2.41±0.72)、0分。PAMD组、模型组神经功能损伤评分高于假手术组(P均<0.05)，PAMD组神经功能损伤评分低于模型组(P<0.05)。

2.2 各组缺血再灌注侧脑梗死情况比较 肉眼可观察到模型组、PAMD组缺血侧有不同程度的梗死灶，对侧无梗死灶，梗死区域与大脑中动脉所支配的脑区一致。PAMD组、模型组、假手术组再灌注侧脑梗死体积分别为(23.56±5.47)%、(37.42±6.55)%、0。PAMD组、模型组再灌注侧脑梗死体积大于假手术组(P均<0.05)，PAMD组脑梗死体积小于模型组(P<0.05)。

2.3 各组缺血再灌注侧脑皮质NR2B、p-NR2B相对表达量比较 PAMD组、模型组、假手术组再灌注侧脑皮质NR2B相对表达量分别为0.26±0.05、0.25±0.03、0.24±0.02。三组缺血再灌注侧脑皮质NR2B相对表达量相比，P>0.05。PAMD组、模型组、假手术组缺血再灌注侧脑皮质p-NR2B相对表达量分别为0.39±0.09、0.49±0.04、0.37±0.06，PAMD组、模型组再灌注侧脑皮质p-NR2B相对表达量高于假手术组(P均<0.05)，PAMD组再灌注侧脑皮质p-NR2B相对表达量低于模型组(P<0.05)。

3 讨论

缺血性脑血管疾病常导致血脑屏障受损和破坏，从而伴发脑水肿。本研究结果显示，PAMD可减少脑缺血再灌注导致的大鼠脑梗死体积，降低神经功能损伤评分，证实其可预防脑缺血再灌注损伤。脑缺血时病理损害涉及的病理生理变化较复杂，包括多个方面，兴奋性毒性损害是目前广泛认可的机制之一。脑缺血后，脑组织缺氧缺糖，能量供给障碍，细胞膜去极化，缺血中心区细胞迅速坏死，缺血损伤进一步级联损害缺血半暗带，引起谷氨酸等兴奋性氨基酸递质生物功能增强，细胞内Ca2+超载，大量生成自由基，引发线粒体功能异常和氧化应激损伤。由谷氨酸诱导的兴奋性神经毒性在缺血性神经元损伤发展过程中发挥复杂而重要的作用，离子型谷氨酸受体NMDAR被认为与兴奋性神经毒性密切相关[8～10]。

NMDAR是中枢神经系统中一类重要的兴奋性氨基酸受体，具有配体、电压双重门控特性，对Ca2+有高通透性，但静息状态下Mg2+结合在通道内，阻止Ca2+内流。当受体激活后，离子通道打开，Ca2+、Na+内流和K+外流，突触后膜产生兴奋性去极化电位，内流的Ca2+激活细胞内相关信号通路，产生相应的生物学效应。NMDAR是由NR1、NR2A-D及NR3A-B等7种亚单位组成的异源四聚体复合物，其中NR1是该受体的功能亚单位，NR2是该受体的调节亚单位，功能性 NMDAR主要是由2个 NR1亚单位结合2个NR2亚单位构成[11～13]。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组再灌注侧脑皮质NR2B表达量无明显差异，但p-NR2B表达量增加；与模型组比较，PAMD组再灌注侧脑皮质p-NR2B表达量降低。有文献报道，在缺血损伤24 h或缺血15 min再灌注6 h后，沙鼠海马中NR2B蛋白表达量无明显变化[14,15]。推测本研究大鼠脑缺血再灌注后皮层部位的损伤可能由于其比海马较为丰富的侧支循环而出现较晚且程度较轻，因而NR2B蛋白表达虽有变化但无统计学差异。另外，与假手术组比较，模型组皮层p-NR2B蛋白表达显著升高，说明NR2B蛋白磷酸化能引起脑缺血再灌注后脑组织损伤。有报道，沙鼠海马中p-NR2B蛋白在缺血15 min表达量显著降低，再灌注15 min即迅速上升，并可维持48 h的高表达状态[15]；本研究结果与其相符。

综上所述，PAMD对大鼠脑缺血再灌注损伤有预防作用；其机制可能与抑制NR2B磷酸化有关。

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