CTTN基因沉默对非小细胞肺癌A549细胞侵袭能力的影响

刘迪，龙谦，罗猛，胡剑，梅宏

(贵州省人民医院，贵阳550002)

最近研究发现，侵袭性伪足与肿瘤的侵袭、转移有密切关系[1～4]。文献报道，肿瘤细胞侵袭和转移早期通常会形成丝状伪足、片状伪足或侵袭性伪足等各种伪足，其中侵袭性伪足因在细胞运动中发挥关键作用而备受关注[5]。皮层肌动蛋白(Cortactin)是由位于染色体11q13区上的癌基因CTTN所编码的一种蛋白质，可作为致癌物质酪氨酸蛋白激酶v-src的底物与微丝激动蛋白和致癌性酪氨酸激酶v-Src结合，从而影响细胞侵袭以及肿瘤转移灶形成[6]。CTTN基因能够促进食管癌细胞系的运动和侵袭[7]，但其CTTN对非小细胞肺癌(NSCLC)侵袭和转移的影响鲜见报道。2016年1月～2017年1月，本研究观察了CTTN基因沉默对NSCLC细胞侵袭能力的影响，以期为肿瘤靶向治疗提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：NSCLC A549细胞(下称A549细胞)购于美国ATCC细胞库。主要试剂：Lipofectamine2000购于美国Invitrogen公司，10% FBS购于浙江天杭生物科技股份有限公司，DMEM高糖培养基购于美国Hyclone公司，兔抗Cortactin蛋白一抗购于美国Abcam公司，山羊抗兔二抗、RIPA裂解液购于北京索莱宝科技有限公司，Tritc-鬼笔环肽购于上海翊圣生物科技有限公司，羊抗兔Dyligt488荧光二抗购于美国Abbkine公司，小干扰RNA(siRNA)由广州市锐博生物科技有限公司设计合成。主要仪器：蛋白成像系统(Fluorchem Q型)购于美国Alpha公司，激光共聚焦显微镜(LSM 700型)购于德国ZEISS公司，Transwell小室购于美国Corning公司。

1.2 细胞培养及CTTN基因沉默 将A549细胞以含有10% FBS的DMEM高糖培养基作为完全培养基，37 ℃、5% CO2条件下进行常规培养。待A549细胞处于对数生长期时，将其以1×105个/mL接种于6孔板，每孔2 mL完全培养基。待细胞融合至60%左右时随机分为观察组和对照组，两组均采用Lipofectamine2000脂质体转染法分别转染CTTN siRNA、阴性siRNA(siRNA:Lipofectamine2000=5 μL∶5 μL)。作用48 h时取两组细胞，采用Western blotting法检测Cortactin相对表达量：采用RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白。SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳进行蛋白分离，冰水浴中100 V电压下转膜100 min。脱脂奶粉封闭1 h，加入兔抗Cortactin一抗(稀释比例为1∶3 500)室温孵育1 h，加入山羊抗兔二抗(稀释比例为1∶5 000)室温孵育1 h，加入ECL化学发光液后于Fluorchem Q型蛋白成像系统进行曝光，采用Image J软件分析条带灰度值。以目的蛋白与内参蛋白GAPDH灰度值的比值计算目的蛋白相对表达量。

1.3 CTTN基因沉默后细胞侵袭性伪足数量检测 作用48 h时取两组细胞，于1 mL细胞悬液中计数3 000个细胞，加到直径为15 mm的共聚焦小皿中。细胞充分贴壁后，4%多聚甲醛固定，0.2% TRIton-X-100破膜。加入兔抗Cortactin蛋白一抗(稀释比例为1∶1 000)室温孵育1 h，加入呈绿色荧光的羊抗兔Dyligt488荧光二抗(稀释比例为1∶2 000)室温孵育1 h，加入呈红色荧光的Tritc-鬼笔环肽5 μg/mL室温避光孵育30 min。共聚焦显微镜下Tritc-鬼笔环肽标记的F-actin和Dyligt488标记的Cortactin共定位于细胞核周围，并呈现黄色荧光，即为侵袭性伪足。使用LSM700型激光共聚焦显微镜随机选取5个视野，计算共定位的黄色荧光(侵袭性伪足)细胞数占细胞总数的百分率，即侵袭性伪足百分率。

1.4 CTTN基因沉默后细胞侵袭能力检测 采用Transwell小室试验。试验前1天将Matrigel基质胶置于4 ℃冰箱中融化过夜，试验时用预冷的枪头抽取已用无血清培养基稀释至1 mg/mL的Matrigel基质胶80 μL，铺于孔径为8 μm的Transwell小室膜上。基底膜水化后，取两组作用48 h的细胞，从1×106个/mL密度的无血清细胞悬液中抽取200 μL加至Transwell上室。24孔板下室加入700 μL完全培养基。作用24 h后，弃去孔中培养液，甲醇固定20 min；吉姆萨染色20 min，PBS洗涤2遍，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞。200倍显微镜下随机选取5个视野，计数穿过基底膜的细胞。

2 结果

2.1 两组Cortactin相对表达量比较 观察组与对照组Cortactin相对表达量分别为0.17±0.02、0.79±0.15，两组比较P<0.05。

2.2 两组细胞侵袭性伪足数量比较 观察组与对照组侵袭性伪足百分率分别为(22.37±4.80)%、(71.46±8.90)%，两组比较P<0.05。

2.3 两组细胞侵袭能力比较 观察组与对照组穿过基底膜的细胞数分别为(51±10)、(220±27)个，两组比较P<0.05。

3 讨论

细胞伪足是肿瘤细胞侵袭和转移的主要工具，尤其是侵袭性伪足在细胞运动过程中具有重要作用。肌动蛋白是细胞伪足的主要组成部分，也是导致肿瘤细胞侵袭和转移的主要参与蛋白[8]。有研究通过免疫荧光标记的方法检测发现，肌动蛋白构成的蛋白微丝明显富集于细胞伪足[9]。另有文献采用活体荧光标记肌动蛋白，证实微丝骨架在侵袭性肿瘤细胞伪足前沿的延展和形态构建中发挥重要作用[10]。CTTN基因编码的Cortactin是一种微丝肌动蛋白结合蛋白，可与肌动蛋白微丝的侧面结合，并直接参与细胞骨架的成型[11]。目前研究发现，Cortactin是连接细胞骨架重建信号通路中的关键分子，在调控细胞运动、侵袭性以及肿瘤转移灶形成中发挥关键作用[12];Cortactin广泛分布于诸如层状伪足、侵袭性伪足和细胞膜皱褶等[13]；Cortactin参与了众多以肌动蛋白为基础的过程，包括细胞极性、伪足形成、细胞黏附和运动等[14]；在病理情况下，如肿瘤分化、侵袭和转移等，组织Cortactin表达异常升高[15]。

本研究采用siRNA将CTTN基因进行特异性沉默，结果显示观察组Cortactin相对表达量明显低于对照组，不仅表明CTTN基因确实编码Cortactin蛋白，并证实本研究采用脂质体转染法成功沉默CTTN基因。本研究结果显示，观察组侵袭性伪足及穿过基底膜的细胞数均明显低于对照组，表明观察组细胞侵袭性伪足形成被抑制，细胞侵袭能力降低。说明CTTN基因在细胞的侵袭过程中可能发挥重要作用，沉默CTTN基因可通过减少A549细胞侵袭性伪足的产生而降低其细胞侵袭能力。但本研究只是通过细胞实验证实CTTN基因参与调控肿瘤细胞运动与侵袭，其在动物模型及临床出现肿瘤转移患者中的表达变化与作用机制仍需进一步研究。

[1] 郭称明,彭会云,罗文,等.ELMO 蛋白家族与恶性肿瘤侵袭转移关系的研究进展[J].中国病理生理杂志,2015,31(12):2296-2300.

[2] 杨丽华,沈星凯,李静秋,等.微RNA通过调节上皮间质转化影响肿瘤转移[J].遗传,2014,36(7):637-645.

[3] Wang T, Zhou C, Zhou Q. Extent of visceral pleural invasion affects prognosis of resected non-small cell lung cancer: a meta-analysis[J]. Sci Rep, 2017,7(1):1527.

[4] 葛臻琼,闫恩利,孙学蓉,等.Noth2调控舌鳞癌干细胞的增殖、侵袭和迁移[J].中国组织工程研究,2016,20(45):6753-6759.

[5] Meng DF, Xie P, Peng LX, et al. Erratum to: CDC42-interacting protein 4 promotes metastasis of nasopharyngeal carcinoma by mediating invadopodia formation and activating EGFR signaling[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2017,36(1):33.

[6] Lopez-Guerrero AM, Tomas-Martin P, Pascual-Caro C, et al. Regulation of membrane ruffling by polarized STIM1 and ORAI1 in cortactin-rich domains[J]. Sci Rep, 2017,7(1):383.

[7] 崔文燕,郭明,原园,等.食管鳞状细胞癌组织中23种肿瘤相关蛋白的表达[J].郑州大学学报(医学版),2012,47(5):598-601.

[8] 潘志兵.肌动蛋白解聚因子与细胞伪足及肿瘤侵袭转移的关系[J].现代医药卫生,2014,30(6):860-862.

[9] van Haastert PJ, Keizer-Gunnink I, Kortholt A. Coupled excitable Ras and F-actin activation mediates spontaneous pseudopod formation and directed cell movement[J]. Mol Biol Cell, 2017,28(7):922-934.

[10] Tönisen F, Perrin L, Bayarmagnai B, et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer[J]. Eur J Cell Biol, 2017,96(2):218-226.

[11] Marioni G, Zanoletti E, Mazzoni A, et al. Cortactin and phosphorylated cortactin tyr expression in temporal bone carcinoma[J]. Am J Otolaryngol, 2017,38(2):208-212.

[12] Alicea D, Perez M, Maldonado C, et al. Cortactin is a regulator of activity-dependent synaptic plasticity controlled by wingless[J]. J Neurosci, 2017,37(8):2203-2215.

[13] Zhang X, Liu K, Zhang T, et al. Cortactin promotes colorectal cancer cell proliferation by activating the EGFR-MAPK pathway[J]. Oncotarget, 2017,8(1):1541-1554.

[14] Belvitch P, Rizzo AN, Dudek SM. Cortactin in atherosclerosis: just say NO[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2016,36(12):2278-2280.

[15] Wu H, Cheng X, Ji X, et al. Cortactin contributes to the tumorigenicity of colorectal cancer by promoting cell proliferation[J]. Oncol Rep, 2016,36(6):3497-3503.