石墨烯基材料对细胞结构影响的研究进展

肖欢，宁宗

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

碳基纳米材料由于其卓越的性能使其在各领域有广泛的应用前景。在这些碳纳米材料中，石墨烯是最新和最重要的材料之一。2004年，石墨烯由Geim和Novoselov从石墨中分离出来，此后，掀起了对石墨烯的研究热潮[1]。石墨烯基材料(GBMs)主要包括氧化石墨烯、还原性氧化石墨烯和功能化石墨烯。GBMs比表面积高，具有极好的电学、热学及光学性能，在光电领域、能量转换和储存、催化反应和环境应用等领域有着广泛的应用前景[2～4]。近年GBMs在生物成像、癌症诊断、基因传递、组织工程、生物传感、DNA序列分析和药物输送等生物医学领域的潜在应用引起了科学界的高度重视[5～7]。但是，随着GBMs研究及应用的深入，其生物安全性的问题也逐渐受到关注。由于体内试验的局限性，对于GBMs生物安全性的探究主要集中在体外细胞毒性的研究。近年对于GBMs通过何种途径内化、内化后定位于何种亚细胞器、对于这些亚细胞又有何种影响，国内外研究团队从不同角度给出了答案，但尚未见有相关系统性综述。本文首次对GBMs体外细胞毒性的研究进行了系统总结，并展望了其在探究GBMs生物安全性方面的意义。

1 GBMs的内化途径

研究表明，GBMs内化是导致细胞中毒的机制之一；但同时也有研究表明GBMs内化可以运输治疗性药物到细胞，并且可以降低细胞耐药性[8]。类似于富勒烯、碳纳米管等其他纳米材料，GBMs主要通过胞吞作用(网格蛋白介导的胞吞作用、细胞膜穴位内陷介导的内吞作用、巨胞饮作用、吞噬作用)内化到细胞中，GBMs内化到细胞中的途径受颗粒尺寸大小的影响。Mu等[9]将蛋白包裹的氧化石墨烯纳米片按尺寸分离，并发现大尺寸的氧化石墨烯纳米片主要通过吞噬作用进入小鼠间充质祖细胞C2C12，小尺寸氧化石墨烯纳米片主要通过网格蛋白介导的胞吞作用进入细胞。Wu等[10]对氧化石墨烯的研究也表明了其内化途径呈尺寸依赖性。表面化学修饰也影响着GBMs的内化。Chatterjee等[11]发现，氧化石墨烯能被HepG2细胞内化，而还原性氧化石墨烯因其疏水性更强，大部分被吸附到细胞表面而没有被内化。值得注意的是，GBMs内化到细胞中的途径与细胞类型有关。在某些类型的细胞中，不同尺寸大小的氧化石墨烯和还原性氧化石墨烯薄片都可以通过内吞途径被细胞有效地摄入。Linares等[12]通过胞吞抑制剂来研究氧化石墨烯纳米片被成骨细胞Saos-2、肝癌细胞HepG2和巨噬细胞RAW-264.7摄取的内吞途径差异。他们发现在三种细胞系中巨胞饮作用是一种普遍的内化过程，此外，氧化石墨烯可以通过微管依赖途径进入Saos-2细胞，通过网格蛋白介导的胞吞作用进入HepG2和RAW-264.7细胞。Xiong等[13]的研究表明，三维纳米石墨烯(NG纳米粒)通过网格蛋白介导的胞吞作用进入人肝癌细胞HepG2，通过网格蛋白和小窝蛋白共同介导的内吞作用进入人正常肝细胞系HL7702，发现HepG2细胞对三维纳米石墨烯的摄取效率更高，并且三维纳米石墨烯对HepG2细胞的细胞毒性远高于HL7702细胞。所以GBMs的内化途径主要和材料的尺寸大小、表面性质及细胞类型有关；对于不同的内化途径，GBMs的摄取效率不同、细胞毒性也有差异。

2 GBMs对细胞膜的影响

GBMs可以通过主动插入切割细胞脂膜，将大量的磷脂分子从细胞脂膜抽离，从而破坏细胞膜(主要由磷脂双分子层组成)的完整性导致细胞死亡。有研究表明，GBMs也能通过间接机制影响膜的完整性和动力学。Xu等[14]通过体外实验发现，原始氧化石墨烯通过调节和细胞骨架相关的基因包括肌动蛋白抗体Actg2、肌球蛋白Tubb2a和伴肌动蛋白Nebulin，可能会损害细胞膜的完整性和功能。

GBMs对细胞膜的影响与浓度有关。低浓度的GBMs在细胞中表现出低毒性或没有毒性；相反，高浓度的GBMs在其内化期间改变了细胞膜的动力学和完整性，诱导细胞凋亡或坏死。Li等[15]将GLC-82肺癌细胞暴露于高浓度的氧化石墨烯中48 h，诱导细胞质中乳酸脱氢酶的重新分布，细胞膜完整性遭到破坏。在其他细胞类型如乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231和胰腺癌细胞Panc-1中也有类似的结果[16]，表明细胞暴露于高浓度的GBMs会损害膜的完整性。

GBMs的比表面积和形状对细胞膜有明显影响。Akhavan等[17]合成还原石墨烯纳米片并评估了尺寸依赖性的人骨髓间充质干细胞的毒性。该细胞活力测试显示平均横向尺寸为(11±4)nm的还原石墨烯纳米片在1.0 μg/mL时，有明显的细胞毒性；而横向尺寸为(3.8±0.4)μm的还原性氧化石墨烯片仅在浓度高达100 μg/mL，暴露1 h后才有细胞毒性作用。说明同样材料组成的纳米颗粒与微颗粒相比，纳米颗粒毒性更大，原因可能是随着纳米颗粒减小、其表面积会增大，所以在评价不同尺寸固体颗粒(特别是介于纳米到微米之间)的毒性时，以颗粒的比表面积作为毒性评估标准比尺寸更为恰当。Chng等[18]比较了氧化石墨烯纳米带和氧化石墨烯纳米片的细胞毒性，发现纵向拉伸碳纳米管得到的氧化石墨烯纳米带比片状氧化石墨烯纳米片显示更强的细胞毒性。GBMs的表面化学修饰也影响其与细胞膜的相互作用，如利用聚乙二醇、聚乙烯亚胺、壳聚糖等对GBMs进行共价或非共价修饰能减轻其细胞毒性[19]。

综上所述，随着GBMs被细胞摄取，对细胞膜也产生了一定影响。GBMs对细胞膜的影响与与纳米粒的浓度、比表面积、形状、表面化学性质密切相关，这些研究拓展了对其理化性质新的了解，有助于开发理化性质更为安全的GBMs。

3 GBMs对溶酶体的影响

GBMs进入细胞后通常位于内体/溶酶体系统。Chen等[20]研究显示，功能化氧化石墨烯内化后主要分布在乳腺癌细胞4T1的酸性溶酶体中。石墨烯能淬灭荧光染料，为了检测溶酶体中石墨烯的存在，Zhou等[21]将乳腺癌细胞MDA-MB-231用溶酶体特异性荧光探针标记，通过共聚焦显微镜观察到部分溶酶体的荧光淬灭，表明石墨烯位于溶酶体附近或内部。

GBMs对溶酶体的影响呈剂量依赖性。低浓度的GBMs几乎不影响溶酶体膜的完整性，因此不影响细胞活力。然而，高浓度的GBMs能引起溶酶体膜的通透性增加，易导致细胞死亡，包括溶酶体/线粒体依赖性的细胞凋亡，溶酶体依赖性的细胞坏死和溶酶体依赖性的自噬细胞死亡[22]。最近，GBMs对细胞自噬的影响吸引了越来越多的关注。有研究表明，氧化石墨烯在巨噬细胞溶酶体中累积导致溶酶体膜不稳定，减少了自噬小体的降解[23]。鉴于GBMs对细胞溶酶体和细胞自噬表现出的潜在毒性机制，应提高GBMs在生物医学应用的安全性。

4 GBMs对线粒体的影响

内化的GBMs可定位到线粒体中，干扰其结构和功能，导致细胞代谢与功能的损伤，从而诱发疾病。因此，探索GBMs和线粒体之间相互作用的机制是非常有价值的。Li等[15]使用透射电子显微镜观察到人肺腺癌细胞GLC-82线粒体中氧化石墨烯的累积。

有研究者[24]发现，氧化石墨烯能进入胎鳉科鱼肝癌细胞系PLHC-1并定位于线粒体中，破坏线粒体膜完整性与通透性，使线粒体膜电位降低、细胞内活性氧簇增多。Zhou等[21]将氧化石墨烯与乳腺癌细胞MDA-MB-231共培养，发现氧化石墨烯定位于线粒体及其周围，引起线粒体膜去极化和线粒体膜电位降低；同时发现氧化石墨烯在线粒体内呈剂量依赖性抑制Fe-S中心在电子传递过程将Fe3+还原成Fe2+的能力，抑制琥珀酸脱氢酶活性和电子传递链复合物活性，由此干扰线粒体的产能过程。Li等[22]发现，原始石墨烯能引起鼠单核细胞系RAW 264.7线粒体膜发生去极化，呈时间和剂量依赖性引起活性氧簇增加及线粒体膜电位下降，并且激活由线粒体介导的细胞凋亡；同时促使Bim(Bcl-2家族凋亡蛋白前体)激活，进而引起Bcl-2家族凋亡蛋白Bax积累，使线粒体外膜通透性增加、凋亡因子前体释放入胞质，引起Caspase级联反应，从而诱导细胞凋亡。

5 GBMs对细胞核及细胞骨架的影响

细胞核是遗传物质的主要存储中心，能调控细胞的生命活动。GBMs能进入细胞核，引起基因毒性。Jin等[25]报道，氧化石墨烯可以进入人肺腺癌细胞A549，定位于细胞质和细胞核。Zhang等[26]将纳米石墨烯片与人成骨样细胞MG63共培养24 h后，发现部分纳米石墨烯片进入细胞核；并且发现纳米石墨烯片被MG63细胞摄取后，能损伤亚细胞器结构，促进细胞凋亡。Qiao等[27]比较了氧化石墨烯(2 μm)和其他纳米材料(50 nm)在人成纤维细胞中的DNA毒性，发现不同的材料引起DNA损伤的程度有所差异，并且氧化石墨烯的基因毒性大于其他纳米材料。Qiao等进一步对不同材料的毒性作用进行了浓度测试，发现石墨烯在1 μg/mL时就能引起DNA损伤，而纳米颗粒二氧化硅、氧化锌、二氧化钛、锡和碳纳米管仅在高浓度(100 μg/mL)才会引起DNA损伤，因此推测石墨烯能引起严重的基因毒性。Akhavan等[17]研究了石墨烯的大小和浓度对人骨髓间充质干细胞DNA的影响，发现平均横向尺寸为(3.8±0.4)μm的石墨烯在100 μg/mL浓度时出现DNA毒性，同时发现在0.1 μg/mL和1 μg/mL低浓度时，平均横向尺寸为(11±4)nm的石墨烯能够渗透到骨髓间充质干细胞的细胞核，并引起DNA碎裂、染色体畸变。所以GBMs对细胞核的基因毒性与材料的尺寸及浓度有关。

细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系(由微管、微丝及中间纤维组成)，通常也被认为是广义上细胞器的一种。GBMs内化后可以损伤细胞骨架结构，破坏细胞功能。Matesanz等[28]研究显示，氧化石墨烯纳米片位于成骨细胞Saos-2的F-肌动蛋白细丝上，在其内化后，通过细胞骨架依赖的方式影响细胞周期，造成细胞死亡。Zhou等[20]观察了氧化石墨烯对细胞骨架动力学的影响，将乳腺癌细胞MDA-MB-231暴露于氧化石墨烯中，导致F-肌动蛋白细胞骨架的破坏，从而减弱细胞迁移。因此，GBMs可以通过直接和间接机制影响细胞骨架。

6 展望

近年来，GBMs凭借其优良的理化性质在生物成像、癌症诊断、基因传递和药物载体等生物医学领域显示出良好的应用前景，但是其潜在的健康风险不容忽视，GBMs与细胞膜的相互作用与GBMs的浓度、比表面积、形状密切相关。通过对GBMs表面进行功能化、减少其粒径大小等措施可以提高GBMs的运输效率，减少其不良作用。

GBMs的细胞毒性与其内化及在细胞的定位有关，但目前这方面的的研究甚少，有待进一步探究。尽管可以通过控制GBMs的大小，形状和表面化学修饰来提高GBMs的生物相容性，但其细胞毒作用仍有许多问题值得探究，例如：①虽然已有大量研究表明GBMs能够通过内吞作用进入细胞，但是进入细胞乃至细胞器的具体通路以及其最终代谢命运并不清楚，生物体对GBMs的代谢或改变而产生的作用并不确定，有必要对其内吞转移机制及信号转导机制进一步研究。②在毒性方面只有经过大批量的筛选才能确定纳米毒性的整体水平，单单局限于几种细胞是远远不够的。③关于GBMs的生物毒性作用的研究主要集中在体外细胞培养阶段，然而体外研究易受培养环境影响，无法真实反映对体内细胞的毒性作用，而对于体内毒性研究还需考虑经济与伦理方面的问题，因此希望在将来能够开发可以替代活体试验的检测手段。④关于GBMs对溶酶体、线粒体、细胞核及其他细胞器(内质网、高尔基体等)相互作用影响的研究相对较少，因此亟需展开此方面的研究工作。⑤有必要进一步拓展流式细胞仪等高通量筛选技术与基于细胞毒性机制的实验方法相结合，有助于建立多样化的理化参数与细胞毒性的关系模型。总之，除了从细胞水平上研究GBMs的生物安全性，还需结合分子、组织、器官及整体动物水平深入研究GBMs与生物之间的相互作用机制，为其在生物医学等领域的安全应用提供理论依据和科学指导。