EAAs在脑缺血损伤中的毒性作用及其干预药物

张欢欢，高原雪，何林，李敏，王斌，康亚国

(陕西中医药大学，陕西咸阳712046)

兴奋性氨基酸(EAAs)是指具有2个羧基和1个氨基的酸性游离氨基酸，包括谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)。正常情况下，兴奋性氨基酸主要存在于神经末梢的突触囊泡内，末梢去极化时释放至突触间隙，作用于突触后膜的特异性受体，完成兴奋性突触传递及其他生理作用。脑缺血损伤的机制涉及Ca2+超载、炎症反应、EAAs积聚等多个环节，它们相互作用、相互影响，最终导致大脑皮层细胞和海马神经元损伤或死亡以及脑组织坏死软化[1]。脑缺血损伤过程中，中枢神经系统EAAs积聚，突触后膜的EAAs受体被过度激活，刺激脑细胞发生一系列变化，最终导致脑细胞死亡。本文结合文献阐述了EAAs在脑缺血损伤中的毒性作用及其干预药物，旨在为脑缺血损伤的治疗及其药物研发提供参考。

1 EAAs及其受体概述

1.1 EAAs及其作用 EAAs是中枢神经系统的兴奋性神经递质，在生理状态下，可参与突触的兴奋传递，促进学习记忆。但在病理状态下，EAAs含量升高，可触发中枢神经系统过度兴奋，导致神经系统能量代谢失衡，产生神经毒性作用[2，3]。EAAs主要包括Glu、Asp，其中Glu对神经元损伤具有关键性作用。Glu是脑内含量最高的氨基酸，以大脑皮层和海马含量最高。但Glu不能通过血脑屏障，只能由葡萄糖和其他前体经不同化学途径在脑内合成[4]。生理状态下，脑细胞外的Glu不断被神经元或胶质细胞上的Glu转运体转运至脑细胞内，故脑细胞内储存了较多的游离Glu，而细胞外液中Glu含量较低。当神经元等细胞去极化时，细胞内Glu释放到突触间隙，与突触后膜不同亚型Glu受体结合，完成兴奋性突触传递及其他生理作用，随后依赖神经元和胶质细胞膜上Glu转运体摄回而被迅速灭活，通过谷氨酸-谷氨酰胺循环转化成新的Glu进行再循环，故不易引起EAAs毒性作用。而在病理状态下，Glu大量释放或Glu清除障碍，Glu在细胞间隙大量堆积，产生很强的神经毒性作用。李宁等[5]采用脑内微透析技术监测脑缺血大鼠海马细胞外液中EAAs含量变化，发现缺血20 min细胞外液Glu、Asp含量开始明显升高，之后持续性升高，缺血60 min达到高峰，并发现脑缺血程度与EAAs释放量呈正相关关系。李菊等[6]观察了大鼠脑缺血30、60 min时海马细胞外液EAAs含量，发现缺血60 min时海马细胞外液EAAs含量明显升高，而且缺血越严重，EAAs含量越高。有研究还发现，细胞外间隙中EAAs含量升高亦能产生兴奋性神经毒性作用[4，7]。程方敏等[7]研究发现，脑梗死急性期(发病12 h内)脑脊液中Glu、Asp含量即明显升高，比CT能检测到病灶提前了36～60 h。因此认为，EAAs可早期诊断脑梗死发生。武祺等[8]通过分析50例脑梗死患者脑脊液发现，脑脊液中Glu在发病24 h内即可明显升高，而这种升高状态可持续1周。研究发现，动物在脑缺血2 h内细胞外液即可出现Glu、Asp明显升高，而脑梗死患者则多在缺血24 h内明显升高[1]，这可能与种属、脑缺血程度等有关。

1.2 EAAs受体及分布 与EAAs相关的受体主要为Glu受体。Glu受体主要有离子型受体和代谢型受体两种。离子型受体包括NMDA受体、AMPA受体、KA受体和L-AP4受体，后三种又称为非NMDA受体。而NMDA受体又包含NR1、NR2(NR2A、NR2B、NR2C、NR2D)、NR3(NR3A、NR3B)亚型，主要分布于突触前膜、突触后膜和突触后致密区以及非突触细胞膜上。其中，NR1广泛分布于中枢神经系统，以海马、大脑皮层、小脑最丰富；NR2一般存在于具有NR1的特定脑区，主要作用是提升NR1对氨基酸的反应；NR3主要存在于海马、脑皮质和运动神经元中。AMPA受体由GLUR1、GLUR2、GLUR3和GLUR4四个亚单位组成，主要分布于突触后膜、树突的表面和细胞质中。KA受体由Glu5、Glu6、Glu7、KA1和KA2五种亚基组成，主要分布在海马区、脑皮质区和小脑等部位，尤其在海马区分布最为密集[9]。L-AP4受体可能主要位于兴奋性突触的前膜，对Glu的释放起负反馈作用。而代谢型受体包括mGluR1、mGluR3-8，主要分布于大脑皮层和海马等处的突触前膜和突触后膜上[10]。

2 EAAs毒性损伤及其机制

目前认为，EAAs受体在兴奋性毒性损伤过程中发挥着重要作用。当NMDA受体激活时，其偶联的阳离子通道开放，允许Na+、K+和Ca2+通过，从而触发时程增强和长时程抑制，对大脑学习、记忆、认知等有积极影响。而AMPA受体和KA受体介导Na+和Ca2+引起突触后膜去极化，从而引起快速兴奋性神经传导[4]。mGlu受体中mGluR1和mGluR5活化可加重脑组织损伤，而剩余的其他受体活化后则可减轻脑组织损伤[10]。另外，Glu转运体在维持胞外Glu含量上具有重要作用，能够迅速再摄取胞外Glu，从而维持较低的Glu含量。Glu转运体主要分为囊泡Glu转运体(VGLUTs)和质膜型Glu转运体(EAATs)。VGLUTs有三种亚型，其中VGLUT-1和VGLUT-2是中枢神经系统内最主要的亚型，能够将细胞质内L-Glu转运至囊泡内，调节Glu隔离、储存和释放，进而影响突触间隙Glu含量，影响Glu突触传递[11]；EAATs有五种亚型，即GLAST/EAAT1、GLT-1/EAAT2、EAAC1/EAAT3、EAAT4和EAAT5，其中GLAST/EAAT1和GLT-1/EAAT2是最重要的胶质细胞转运体。GLT-1/EAAT2能够重摄取绝大部分细胞外的Glu，是中枢神经系统中最重要的Glu转运体[12～14]。有研究显示，兴奋性毒性损伤与能量代谢障碍、氧自由基、一氧化氮和血小板活化因子有关[15]。主要原因是Glu含量过度增加导致的爆发性释放和Glu清除障碍。

Glu爆发性释放的毒性作用主要体现在以下几方面：①急性渗透性损伤。由AMPA/KA受体过度兴奋介导的急性损伤，可在数小时内发生。脑缺血时突触间隙过量的EAAs激活突触后膜上AMPA/KA受体，使得Na+通道开放，Na+和Cl-内流，导致细胞内渗透压上升，大量的水分由细胞外液进入细胞内，造成细胞水肿和渗透性溶解。一般情况下，星形胶质细胞最先发生水肿，从而延迟了神经元水肿，起到限速细胞毒性脑水肿作用，但星形胶质细胞的限速作用有限，一旦突破会引起严重脑水肿。②迟发性神经元损伤。由NMDA受体过度兴奋介导，数小时或数天内发生[15]。脑缺血后，Ca2+依赖性氨基酸神经递质释放，但因细胞缺血缺氧逐渐引起能量丧失，导致Ca2+依赖性氨基酸神经递质释放无法维持，引起Na+内流，K+外流，细胞膜内外离子浓度严重失衡，进而非Ca2+依赖性的Glu转运体翻转[16，17]，引起神经元和胶质细胞的Glu向胞外释放，使得细胞间隙的Glu蓄积，不仅导致缺血中心组织出现坏死，还可引起缺血区周围神经细胞出现缓慢坏死。过量的Glu可激活抑制型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体，影响离子通道的正常功能，过度的Ca2+内流引起神经细胞坏死或凋亡，导致严重的脑缺血性损伤[18]。而Ca2+内流使细胞内Ca2+增多，可激活蛋白酶、磷脂酶、DNA酶等，使蛋白质、磷脂等降解，产生花生四烯酸，在环氧酶2和5-脂氧酶催化下生成前列腺素和白三烯类，从而介导炎症反应。

当脑缺血时，蛋白激酶C和支架蛋白的激活可引起GLT-1/EAAT2从细胞膜至细胞内再分布，加上溶酶体降解，从而导致其表达下调，引起Glu清除障碍[19]。有研究表明，敲除小鼠脑皮质中GLT-1/EAAT2基因，其突触释放氨基酸的水平增加并且持续时间增长。另有研究利用腺病毒载体使GLT-1/EAAT2在大鼠脑皮质局部过表达，发现其可显著减少脑缺血导致的Glu外流、细胞凋亡并促进神经功能恢复。因此，调控GLT-1/EAAT2有可能减轻脑缺血损伤[20，21]。

3 治疗EAAs毒性损伤的药物

基于脑缺血损伤的兴奋性毒性机制，临床上治疗EAAs毒性损伤的药物主要分为NMDA受体拮抗剂和Glu转运体调节剂。NMDA受体拮抗剂是目前治疗脑缺血损伤的主要药物，如地佐环平、美金刚、右美托咪定、布美他尼和氧化槐定碱等。地佐环平可通过抑制钙超载和刺激神经干细胞增殖而保护神经元，0.6 mg/kg干预即可减轻脑缺血大鼠EAAs对神经元的毒性作用和内源性神经干细胞增殖的影响，从而发挥神经细胞保护作用[22]。美金刚20 mg/kg给予脑缺血大鼠，可显著下调Caspase-3表达及NMDA生成，从细胞膜受损、功能障碍和细胞凋亡等环节上阻止神经细胞损伤发生[23]。右美托咪定预处理脑缺血再灌注大鼠，再灌注后各时间点Glu、Asp含量和NMDAR1表达均较模型组明显降低，提示右美托咪定可能通过抑制EAAs毒性损伤而发挥脑保护作用[24]。布美他尼30 mg/kg或氧化槐定碱250 mg/kg静脉预给药可降低脑水肿和NMDAR1表达，从而显著抑制EAAs毒性，减轻大鼠脑缺血再灌注损伤[25，26]。

另外，通过调节Glu转运体活性也可减轻兴奋性毒性损伤，常用的Glu转运体调节剂有囊泡型Glu转运体抑制剂、质膜型Glu转运体激动剂两类。囊泡型Glu转运体抑制剂有偶氮类染料和玫瑰红等染料类，犬脲氨酸和2，4-二羧酸喹啉等取代的喹啉类以及其他一些氨基酸、脂肪酸等，均有抑制囊泡型Glu转运体的作用[11]。染料类抑制剂作用较强，但特异性较差，毒副作用较多；而喹啉类虽具有一定毒副作用，但其抑制作用特异性较好，具有较高的研发价值。质膜型Glu转运体激动剂有头孢曲松、他莫西芬、17β-雌二醇等，可通过介导蛋白激酶A和NF-κB信号通路一条或两条信号通路，激活Glu转运体的活性或上调其表达，使突触间隙的Glu被迅速清除，阻断兴奋性神经毒性，减轻脑水肿程度，从而发挥脑保护作用[12，19，27]，但长期应用头孢曲松会损害大鼠空间学习和记忆，需谨慎使用。近年大量研究表明，中药及其复方制剂亦能抑制EAAs的释放和下调NMDA受体表达，发挥神经元保护作用，如芍药甘草汤、夜交藤提取物、康脑液、芪棱汤、补阳还五汤和葛根素等[1,28～33]。

综上所述，脑缺血损伤的发病机制复杂，一方面在发病时可能由一种或多种机制同时引起，另一方面在发病过程中往往伴随一种或多种并发症，这给临床治疗带来了极大困难，而EAAs在脑缺血早期进程中发挥重要作用，并与Ca2+超载、能量代谢、细胞凋亡和炎症反应等过程相互影响。因此，了解EAAs在脑缺血损伤发生中的作用及其在脑组织中的动态变化规律，可为脑缺血损伤治疗及药物研发提供依据。