lncRNA在细胞自噬调控中作用的研究进展

陈俊宇，龚向前,2，张爱青,2

(1 南京医科大学第二临床医学院，南京210011；2 南京医科大学第二附属医院)

细胞自噬是一种在进化水平上高度保守的细胞内成分自我降解的过程，对于维持细胞结构和功能稳态具有重要作用[1]。在疾病发生前，细胞自噬通过清除进入细胞内的损伤因子，防止细胞受损；在疾病发生早期，细胞自噬能直接诱导受损细胞死亡，抑制或延缓疾病发展；但当疾病发展至中晚期时，过度激活的细胞自噬可降解细胞正常结构，反而使病情恶化。细胞自噬调控可通过激活自噬相关基因(ATG)启动子、调节转录因子、改变相关蛋白激酶ULK1/2活性等多种方式实现。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸序列的非编码RNA，由于缺乏蛋白质编码功能，最初被认为是基因转录过程中的“噪音”，在很长的一段时间内未得到足够重视。近年研究发现，lncRNA具有较长的碱基序列，拥有多个功能区域，其特异性表达往往能参与多种分子信号通路，发挥不同的生理调控功能，其在细胞自噬调控中存在抑制、促进和双向调控细胞自噬三种作用[2]。本文结合文献对lncRNA在细胞自噬调控中作用的研究进展作一综述。

1 lncRNA概述

分子生物学的中心法则认为，遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，从而完成遗传信息的转录和翻译过程。人类基因组只有20% DNA用于编码蛋白质，其余转录成RNA，但不被翻译成蛋白质，这类不编码任何蛋白质的RNA被称为非编码RNA，其中长度>200个核苷酸的为lncRNA[3]。迄今为止，在人类基因组中发现的lncRNA已超过1×106个。在过去很长的一段时间内，人们普遍认为lncRNA缺乏蛋白质编码能力，是转录过程中的无功能副产物。目前认为，lncRNA作为人类基因组中一类重要的调控分子发挥相应生物学功能。Sun[4]研究发现，lncRNA不仅能够通过碱基配对来介导目标识别，还能在三维结构层面上与DNA、RNA和蛋白质结合，从而组成更复杂的调控网络。lncRNA既可作为信号分子或诱饵分子，参与调控基因的表达与转录，还可作为引导分子或支架分子，影响蛋白质分子的功能与稳定。

2 lncRNA在细胞自噬调控中的作用

细胞自噬主要分为激活启动、游离膜形成自噬体、自噬体与溶酶体融合、降解四个阶段。细胞自噬启动依赖于增多的应激因子(如活性氧、钙离子等)刺激胞内能量感受器[如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、AMP激活蛋白激酶等]，干预应激因子表达或直接调节能量感受器状态，从启动阶段调控细胞自噬。其余三个阶段依赖于各种自噬相关基因转录和翻译过程中产生的蛋白作用原件，如招募游离膜聚集的Beclin 1、伸长游离膜形成自噬体的ATG8-磷脂酰乙醇胺及帮助其他自噬蛋白定位的Ⅲ类PI3K复合物，通过激活基因启动子或结合转录因子，抑制相关基因表达、增强蛋白质稳定性、抑制蛋白质磷酸化等，实现对细胞自噬调控[5]。lncRNA能调节自噬相关的DNA、RNA或蛋白质的功能与活性，或影响自噬相关的应激因子与能量感受器，从而参与细胞自噬的调节。目前认为，参与细胞自噬调控的lncRNA可分为三类，即抑制细胞自噬的尿路上皮癌胚抗原(UCA1)、心肌自噬抑制因子(CAIF)、HAGLROS等；促进细胞自噬的转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)、肝癌高表达转录本(HULC)、HOX转录反义RNA(HOTAIR)、SOX2OT变体7(SOX2OT-V7)等；双向调控自噬的lncRNA H19、母系表达基因3(MEG3)等。

2.1 抑制细胞自噬的lncRNA Liu等[6]通过生物信息学方法筛选出多种与自噬高度相关的lncRNA，部分lncRNA表达可明显抑制细胞自噬现象，二者呈负相关关系。说明这些lncRNA具有抑制细胞自噬的作用。常见抑制细胞自噬的lncRNA有UCA1、CAIF、HAGLROS等。

UCA1最早是从人类膀胱癌中发现的lncRNA，定位于人类19号染色体13区，包含三个外显子[7]。在各种恶性肿瘤细胞中，UCA1可与miRNA相互作用，调节肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移。近期研究发现，UCA1还能通过与miR-184竞争性结合，促进能抑制细胞自噬的生长抑制因子1(osgin1)表达，发挥抑制细胞自噬作用。Gao等[8]研究发现，在高浓度砷刺激下的人肝细胞中，自噬体膜标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达明显升高，细胞自噬作用增强，且UCA1表达明显降低；而UCA1高表达则可抑制砷刺激所引起的细胞自噬性死亡。表明UCA1可能是一种抑制细胞自噬的lncRNA。通过高表达UCA1筛选其可能相关的下游候补基因，发现氧化应激诱导的osgin1在RNA测序中最敏感。之后通过生物信息学分析发现，UCA1与miR-184、osgin1三者的结合位点相同，提示UCA1调控细胞自噬的通路可能与miR-184、osgin1有关。最近研究证实，miR-184可通过与osgin1的3′端非翻译区结合而促进osgin1表达；UCA1可通过竞争性内源性RNA抑制miR-184表达，从而调节osgin1表达并抑制细胞自噬。

CAIF是Liu等[9]在心肌细胞研究中发现的一种lncRNA。在心肌细胞中，CAIF可通过降低心肌素(Myocardin)表达而抑制自噬囊泡聚集，继而抑制细胞自噬。研究发现，在H2O2诱导心肌细胞自噬的过程中，Myocardin表达显著增加，Myocardin敲除可明显降低H2O2诱导的心肌细胞自噬，而Myocardin过表达则可明显增强心肌细胞自噬囊泡聚集。对Myocardin启动子区域分析发现，Myocardin启动子区域存在潜在的p53结合位点。在正常心肌细胞中p53能与Myocardin的启动子结合，在H2O2处理后的心肌细胞中p53与Myocardin启动子的结合能力明显增强。p53在细胞自噬调控中处于Myocardin上游，并通过结合启动子激活Myocardin表达，从而介导由氧化应激诱发的心肌细胞自噬。最近研究发现，CAIF的3′末端区域能与p53蛋白直接绑定结合，绑定结合后p53蛋白激活Myocardin启动子能力受到明显抑制，通过CAIF/p53/Myocardin途径降低细胞自噬水平。

HAGLROS是一个长度为699 bp的lncRNA(NCBI参考序列：nr_110457.1)，仅有一个转录本[10]。有研究发现，胃癌组织HAGLROS高表达，且其表达变化与患者预后不良有关。Chen等[11]研究发现，HAGLROS能被转录因子STAT3激活而上调表达，其启动子区域的E2结合位点能够与STAT3结合。进一步研究发现，HAGLROS可通过mTOR信号途径抑制细胞自噬，从而促进肿瘤的发生和进展。生物信息学研究发现，HAGLROS可与miR-100-5p结合。miR-100-5p已被证实可引起mTOR mRNA降解，通过降低mTOR蛋白表达进而促进细胞自噬。由此推测，HAGLROS可能以miR-100-5p为下游目标调控mTOR通路。但过表达miR-100-5p并不能完全逆转HAGLROS对mTOR表达的促进作用，表明可能还存在其他调控方式。研究发现，HAGLROS还能与mTORC1元件互动形成稳定的复杂结构，激活mTORC1信号通路，抑制细胞自噬。因此，HAGLROS抑制细胞自噬过程中调节mTOR信号主要通过两种方式，一是竞争性对抗miR-100-5p诱发的mTOR减少，二是与mTORC1元件直接结合，激活mTORC1信号通路。

2.2 促进细胞自噬的lncRNA 有研究发现，某些lncRNA表达与细胞自噬呈正相关关系[12]，表明细胞内还存在促进细胞自噬的lncRNA。目前已发现的可促进细胞自噬的lncRNA有MALAT1、HULC、HOTAIR、SOX2OT-V7等。

MALAT1是一个高度保守的核内lncRNA，定于人类11号染色体1区3带[13]。MALAT1最初是在对人类非小细胞肺癌转移相关基因研究中发现的，可在多种肿瘤组织中高表达，与肿瘤的发生、发展密切相关。近年发现，MALAT1还与细胞自噬调控有关。Yuan等[14]研究发现，在肝癌细胞中MALAT1可与组蛋白复合物相互作用，作为竞争性内源RNA，发挥miRNA分子“海绵体”的作用，结合自噬调控因子miR-216b并抑制其表达，从而促进细胞自噬。YiRen等[15]研究发现，在自噬相关耐药的胃癌细胞中MALAT1高表达，而敲除MALAT1后，ATG12 mRNA表达明显降低，推测MALAT1在胃癌细胞中存在与ATG12有关的自噬调控路径；生物信息学分析发现，发挥分子“海绵体”作用的MALAT1与miR-23b-3p结合，可改善miR-23b-3p对ATG12表达的抑制作用，从而促进细胞自噬。Guo等[16]提出了MALAT1/miR-30a/Beclin 1自噬调节网络，其中miR-30a直接靶向抑制Beclin 1刺激自噬前体产生，MALAT1则作为“海绵体”负向调节miR-30a表达，从而促进细胞自噬。Huang等[17]研究发现，MALAT1还可通过直接抑制miR-124介导STX17表达，从而促进视网膜母细胞瘤细胞自噬，其作用机制可能也与MALAT1的“海绵体”作用有关。

HULC是第一个从人肝癌组织中鉴定出来的特异性lncRNA，其基因序列定位于人类第6号染色体2区4带3亚带[18]。研究发现，HULC可通过转录抑制和表观遗传实现抑制SIRT1蛋白泛素化及ATG7蛋白表达，从而发挥促进细胞自噬作用。Xiong等[19]在HULC对肝癌细胞耐药性影响的研究中发现，过表达或沉默HULC虽无法影响SIRT1 mRNA表达，却能显著影响SIRT1蛋白表达。以往研究证实，SIRT1能通过多种途径促进细胞自噬。以此切入分析HULC促进肝癌细胞自噬的调控机制，发现了HULC-(miR-6825-5p，miR-6845-5p，miR-6886-3p)-USP22-SIRT1的自噬调控网络。证实过表达HULC不仅能抑制SIRT1泛素化，还能上调USP22蛋白表达，提高SIRT1蛋白稳定性。同时还发现，HULC促进USP22蛋白表达是通过抑制miR-6825-5p、miR-6845-5p、miR-6886-3p表达实现的。Chen等[20]研究发现，HULC过表达能降低上皮性卵巢癌细胞中ATG7、LC3-Ⅱ表达并诱导p62表达，继而抑制细胞自噬。鉴于转染HULC干扰RNA处理或ATG7共转染HULC处理均能诱导细胞形成自噬体并高表达ATG7，推测HULC还能通过靶向抑制ATG7蛋白表达来诱导卵巢癌细胞自噬的发生。

HOTAIR是首个以反式转录方式调控基因表达的lncRNA，其基因序列定位于人类12号染色体1区3带的HOX基因C位点上，是由RNA聚合酶Ⅱ转录的HOXC基因的反义链[21]。HOTAIR通过由许多茎环结构组成的复杂二级结构，参与组蛋白修饰并沉默目的基因表达，从而发挥反式调控功能。近年研究发现，HOTAIR通过参与ULK1磷酸化，沉默某些miRNA表达，从而实现促进细胞自噬。在细胞自噬过程中，ULK1通过磷酸化形成p-ULK1而被激活，调节下游ATG9等自噬相关基因，继而参与自噬小体形成，以启动细胞自噬。而沉默HOTAIR表达则可抑制p-ULK1，继而抑制细胞自噬。HOTAIR通过在miR-454-3p基因启动子区域招募EZH2和DNMT1，导致miR-454-3pDNA甲基化，使得miR-454-3p表达明显降低，从而负向调控miR-454-3p。在下调HOTAIR后miR-454-3p表达明显升高，并能观察到细胞自噬明显受到抑制。进一步通过生物信息学软件预测和分析发现，miR-454-3p通过靶向抑制STAT3和ATG12表达而抑制细胞自噬。证实HOTAIR通过沉默miR-454-3p表达并靶向调节STAT3、ATG12，继而发挥促进细胞自噬作用。

SOX2OT-V7是近期发现与细胞自噬调控有关的lncRNA，是人类SOX2OT基因的一种转录变异体[22]。SOX2OT-V7可能在Notch3/DLL3信号通路中扮演下游信号分子的角色，并发挥促进细胞自噬作用。Wang等[23]研究发现，EGCG联合阿霉素可使骨肉瘤细胞自噬增加，并诱导细胞凋亡，继而抑制骨肉瘤生长；进一步研究发现，二者可通过抑制Notch3/DLL3信号通路，促进SOX2OT-V7表达上调，继而靶向调控细胞自噬。证实在骨肉瘤细胞中SOX2OT-V7过表达可促进细胞自噬，并受到Notch3/DLL3通路的靶向调节。但作为一个新发现与自噬调控有关的lncRNA，SOX2OT-V7诱导细胞自噬的具体机制尚不完全清楚，有待进一步研究。

2.3 双向调控细胞自噬的lncRNA lncRNA具有多个功能区域，能够与蛋白质结合形成新的功能结合位点，这为lncRNA双向调控细胞自噬作用提供了可能[24]。目前已发现的具有双向调控细胞自噬作用的lncRNA有lncRNA H19、MEG3等，这些lncRNA在肿瘤研究领域较为常见，可发挥致癌与抑癌双重作用[25]。

lncRNA H19是最早发现的印记基因，为父系基因印记、母系基因表达，基因序列定位于人类11号染色体1区5带5亚带处[26]。近期研究发现，lncRNA H19具有双向调控细胞自噬作用，可通过沉默DIRAS3表达抑制细胞自噬，还可通过增强Beclin 1表达或抑制mTOR磷酸化促进细胞自噬。Zhuo等[27]研究发现，在高糖培养的心肌细胞模型中，敲除lncRNA H19可降低EZH2表达并激活DIRAS3启动子；而过表达lncRNA H19则可降低DIRAS3表达，促进高糖暴露心肌细胞的mTOR磷酸化，进而抑制细胞自噬激活。而近期研究发现，lncRNA H19还能通过其他不同的机制发挥促进细胞自噬作用。Wang等[28]研究认为，lncRNA H19促进细胞自噬作用是通过激活自噬体形成而不是通过抑制自噬体降解实现的。当加入lncRNA H19抑制剂后，除能降低细胞自噬外，还发现DUSP5表达上调；而添加DUSP5 siRNA可解除lncRNA H19抑制剂对细胞自噬的抑制作用，表明DUSP5在细胞自噬调控过程中可能作为lncRNA H19的下游目标。DUSP5-ERK1/2轴是一个新的细胞自噬调控通路。有研究表明，DUSP5-ERK1/2轴存在于lncRNA H19激活的细胞自噬过程中。lncRNA H19可抑制下游目标DUSP5，逆转DUSP5对ERK1/2的抑制作用。Xu等[29]研究表明，lncRNA H19对细胞自噬还具有促进作用，lncRNA H19高表达能激活PI3K/Akt通路，降低mTOR磷酸化，通过抑制mTOR通路促进细胞自噬。

MEG3是由位于人类14号染色体3区2带3亚带上的DLK1-MEG3基因印迹区域转录而来[30]。有研究发现，MEG3在膀胱癌、肺癌及神经胶质瘤细胞中具有抑制细胞自噬作用[31]，其作用主要通过直接与ATG17蛋白结合，影响ATG1-ATG13-ATG17蛋白复合体形成而实现。最近研究发现，MEG3能直接作用于ATG3蛋白而发挥促进细胞自噬作用。Xiu等[32]研究发现，MEG3能参与卵巢癌细胞自噬过程，其作用机制可能通过调控ATG3蛋白表达来实现。ATG3残基侧链已被证实在LC3脂化中发挥重要作用，可参与自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体过程，继而促进细胞自噬，故MEG3表达上调可能通过与ATG3蛋白的相互作用形成复合体来诱导细胞自噬，从而抑制肿瘤的发生、进展。另外，MEG3过表达还能稳定ATG3 mRNA以及抑制放线菌素D对ATG3 mRNA的降解作用，继而促进细胞自噬，但其具体作用机制尚不明确。

综上所述，多种lncRNA能参与细胞自噬的调控，在疾病发生前或发生早期，细胞自噬有利于清除损伤因子，延缓或抑制疾病发展,而到疾病中晚期，细胞自噬被广泛激活可使病情恶化。因此，根据疾病发展将细胞自噬动态调控到合理水平有望成为一种新的治疗手段，拥有不同调控作用的lncRNA数量与种类丰富，既有抑制或促进细胞自噬的lncRNA，也有双向调控细胞自噬作用的lncRNA，或许能满足这种需求。随着lncRNA研究的不断深入，一些新的自噬调控相关lncRNA不断被发现，其调控细胞自噬的作用机制逐渐清晰，这些lncRNA有望通过调控细胞自噬作用成为多种疾病预防与治疗的新靶点。