新西兰大白兔局部牙槽骨缺损模型的建立

庞永志，尹静，王晋，李大鲁(济南市口腔医院，济南250000)

多种口腔常见病(牙周炎、外伤、肿瘤等)均可造成局部牙槽骨缺损，临床修复治疗困难，且病程长。随着国人生活水平及医疗水平的提高，牙齿种植已在临床普遍推广。然而越来越多的患者面临骨量不足的问题。研究探寻理想的牙槽骨再生和修复的生物材料是口腔医学研究的热点与难点。临床急需一种性能与自体骨类似，植入后最终能被爬行替代的人工骨材料。为解决这一临床难题，首先需要选择合适的动物来构建牙槽骨缺损模型，为研究骨替代材料奠定基础。猴、猩猩等灵长类动物牙槽骨与人类最相似，但其价格较高，饲养管理难度较大，难以推广造模；鼠类因个体较小，手术操作不便。成年新西兰大白兔个体适中，性情温顺，价格便宜，便于饲养。兔以前牙抓取切断食物，以磨牙为咀嚼中心进食，所以在其第一磨牙与中切牙之间制作骨缺损，避免因手术造成进食困难，影响研究结果。目前国内有关建立局部牙槽骨缺损模型的研究较少，而在相关研究牙槽骨缺损修复材料的实验中制造牙槽骨缺损的方法各异。2016年11月～2017年2月，本研究建立兔局部牙槽骨缺损模型，为骨移植材料在牙槽骨缺损的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 健康纯种普通级新西兰大白兔20只，3月龄，体质量2.0～2.5 kg、平均2.36 kg，雌雄不限，购自济南西岭角养殖繁育中心，许可证号SCXK(鲁)20100005，饲养于山东省千佛山医院实验动物中心。分笼饲养，实验室常规定期消毒，温度维持20 ℃左右，相对湿度50%±2%，通风良好，按照标准进行饲养。所有动物口腔黏膜颜色正常，牙齿无损坏，舌活动自如。实验过程中对动物的处置参照中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。戊巴比妥钠(德国Merck公司)；AE240型电子分析天平(瑞士METTLER公司)、FSX100型光学显微镜(日本OLYMPUS公司)、Lunar prodigy型双能X线骨密度仪(美国GE公司)、KODAK2200型口腔X射线机(法国Trophy生产)、EX-203型口腔慢速手机(日本NSK公司)、碱性磷酸酶试剂盒(美国sigma公司)、Sunrise型酶标仪(瑞士Tecan公司)、FSH-2A型高速匀浆机(国立常州实验设备研究所)。

1.2 牙槽骨缺损动物模型建立 术前适应性饲养1周，禁食12 h、禁水8 h。经兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)，麻醉后将其仰卧位固定于动物实验台上，术区常规消毒铺巾，口内再次消毒，手指触摸到下颌体上缘黏膜最薄处，于第一磨牙近中龈缘前方约5 mm与切牙远中龈缘后方约5 mm之间用11号尖刀片切开黏骨膜。剥离子剥离暴露骨面，于第一磨牙与中切牙中间处，用口腔科种植手机(800 r/min)配备直径2 mm裂钻垂直制备约4 mm×4 mm×4 mm骨缺损，边磨边生理盐水冲洗，间断磨除，磨至骨松质后用口腔科小刮尺刮至牙根面，生理盐水清洗创面，棉球压迫止血。无明显出血后，用1号线全层缝合切口。造模后在右侧臀大肌处肌注青霉素，40万U/次，2次/d，连续3 d。造模后饲养条件同术前。观察并记录造模后动物精神、饮食、两便、活动及伤口愈合情况。分别于造模后1、4、8、12周各随机选取5只动物经耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠将其处死，完整取出双侧下颌骨体部，去软组织，观察标本局部成骨情况。

1.3 牙槽骨缺损影像学检查 将不同时间点取得的牙槽骨缺损标本置于口腔X射线机下拍片。拍摄条件：距离10 cm，电压70 kV，电流7 mA，曝光时间0.051 s。观察不同时间点骨缺损修复情况。用双能X线骨密度仪测量骨缺损处骨密度，测得骨缺损修复区骨矿盐含量、成骨质量及成骨速度。选取包含骨缺损的6 mm×5 mm范围作为测量区域。每标本测量3次，取平均值。

1.4 牙槽骨缺损组织学变化观察 用口腔科高速手机在骨缺损近远中各2 mm处锯下标本，均分为两份。一份于10%中性甲醛溶液中固定2 d，流动水冲洗2 h，常规脱钙72 h，逐级脱水，石蜡包埋，按颊舌向纵切，连续切取厚度2 μm切片，选取组织块中心部位切片2张，行苏木精-伊红染色，于FSX100显微镜下观察新骨形成情况并采集图片。

1.5 成骨细胞活性测定 取骨缺损标本定量后匀浆，加PBS缓冲液提取，3 000 r/min离心30 min，取上清液。严格按碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒说明书进行操作，用酶标仪于450 nm波长处测吸光度值，获得每克标本中ALP活性作为成骨细胞活性。

2 结果

2.1 造模后不同时间点实验动物一般情况比较 实验动物造模后反应良好，体温不高，精神略差，饮食及活动减少，切口周围软组织略肿胀，3～5 d恢复正常，7 d切口甲级愈合，无感染、裂开、坏死，缝线随饮食自行脱落。术区及周围均未见急性炎症反应。造模后1周牙槽骨缺损切口表面黏膜略红肿，刮除表面瘢痕组织后可见明显凹陷骨洞区，缺损处被肉芽组织及血凝块充填。造模后4周口内黏膜颜色正常，缝线已自行脱落，纵切面观骨缺损处填满纤维组织及纤维骨痂，探有硬度，骨洞区变浅，有少许新生骨形成。造模后8周牙槽骨缺损骨洞进一步变浅，表面粗糙，但凹陷较明显，纵切面观察新生骨与与周围骨界限不清。造模后12周骨缺损处与周围骨组织界限不清，表面略粗糙，骨缺损处凹陷较明显，颜色较周围骨组织偏浅。纵切面观察骨缺损处与周围骨已无界限，但靠近缺损处中央，仍有少量纤维组织残留。

2.2 造模后不同时间点牙槽骨缺损影像学检查结果比较 造模后1周骨缺损处低密度影像明显，边界清晰。造模后4周骨缺损处边缘见云雾状改变，可见阻射的骨小梁影像，以缺损底端最为明显。造模后8周骨缺损处边界分辨不清，骨缺损处密度仍相对较低，低密度影像向中心缩小，骨缺损表面阻射度仍较低。造模后12周缺损处底端与周围松质骨无明显区别，表面骨密度偏低。造模后1、4、8、12周牙槽骨缺损处及非手术区正常牙槽骨骨密度分别为(0.176±0.005)、(0.198±0.011)、(0.277±0.003)、(0.301±0.014)、(0.358±0.011)g/cm2。牙槽骨缺损骨密度值正常牙槽骨>造模后12周>造模后8周>造模后4周>造模后1周，两两比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.3 造模后不同时间点牙槽骨缺损组织学变化比较 造模后1周骨缺损处内部见较多炎性细胞，以急性粒细胞为主，有少许血凝块尚未被吸收。造模后4周骨缺损处见有新生骨小梁生成，但较细，散乱排布，边缘可见单层排列的成骨细胞，骨小梁内骨细胞较为活跃，骨小梁之间有较多血管发生。造模后8周骨缺损处四周骨小梁粗大，较多已联合，纤维组织逐渐减少并开始钙化为类骨质，新生骨与宿主界面不清，成骨细胞密度有所下降，但骨缺损中央处骨小梁较纤细，纤维组织较多。造模后12周骨缺损处骨小梁粗大致密，较多联合成片状，骨小梁边缘成骨细胞较活跃，有丰富的血管网，负重区向成熟的板层骨改建，内部为骨髓腔较大的松质骨结构，但相对周围正常骨床仍显杂乱，骨结构层次性相对稍差。

2.4 造模后不同时间点牙槽骨缺损组织中成骨细胞活性比较 造模后1、4、8、12周牙槽骨缺损组织中ALP活性分别为(2.67±0.13)、(28.24±0.29)、(21.79±0.21)、(11.48±0.38)U/g。造模后第1周ALP活性最低，第4周活性最高，之后逐渐降低，12周时仍维持较高水平，各时间点比较差异有统计学意义(P均﹤0.05)。

3 讨论

牙槽骨缺损的修复与再生一直是口腔医学界亟待解决的问题之一。应用于牙槽骨缺损修复的材料有羟基磷灰石、生物活性玻璃等诸多材料，组织工程技术是修复骨缺损较前沿的研究，然而动物实验是每种材料应用于临床的必经环节，为便于学者们多角度研究牙槽骨缺损行之有效的骨替代材料，动物模型是首要解决的问题。

在研究牙槽骨缺损移植材料的实验动物选择上，早期国外较多学者以大鼠为研究模型[1～3]，大鼠个体小，存在手术操作困难，即使手术造模成功，仍面临骨移植物难以植入的缺点。在牙槽骨缺损重建的研究上，多数学者开始以羊或犬为模型开展研究[4～7]，或者以小型猪为实验对象[8,9]。羊、犬、小型猪均属大型动物，尽管能较好地复制人类牙槽骨缺损模型，但存在饲养成本高、管理难度大等问题。兔成为多数学者的首选，然而模型的制作方法各异。兔上颌骨腭弓弧度较大，黏骨膜较厚，且受张口度的限制，不宜制作骨缺损。在下颌骨的模型制备中，胡杨等[10]提出用拔除双侧下颌中切牙的方式制备缺损模型，但兔切牙牙根较长，牙根一直延续到颏孔位置，牙根尖端与牙颈部直径相当，无明显根尖，成年兔切牙冠根比约为1∶8，牙根牙本质较薄，髓腔粗大，且牙根弯曲明显，拔除较为困难。牙颈部周缘牙槽嵴较薄，拔除中较易出现牙槽嵴骨折，且较易牙根折断，残留断根可能造成骨缺损的研究结果失真。前期研究中，参考吴哲等[11]在大鼠牙槽嵴吸收模型中的方法，用裂钻将兔的切牙牙冠磨除1/2，在其尚未恢复咬合关系时，再次磨除1/2，先后磨除4次后，切牙出现松动，分离牙龈后能够将其拔除，但因反复麻醉，动物数量较多，实验周期过长，不适合作为牙槽骨缺损的模型推广。在进行第一磨牙的拔除时，均遇到同样困难。马跃等[12]在比较倍骼生与羟基磷灰石在牙槽骨的修复效果时，采用纵行劈开下颌骨下缘的方法对比材料性能，此种方法需在口外切开，手术创伤大，操作难度高，造模后可能会影响动物进食。富建明等[13]在下颌骨体部磨牙区颊侧制作1.5 cm×1.5 cm骨缺损模型来研究材料的修复效果，但兔颊侧密质骨约0.44 mm，松质骨约1.34 mm，该厚度较难植入材料，植入材料后材料易流失，难以客观评价材料的成骨效果。房殿吉等[14]通过在兔下颌支颊侧中下制备直径1 cm全层骨缺损，深度0.5～0.6 cm，此方法会磨除部分磨牙牙根，暴露的牙髓组织可能会影响实验结果，且手术会影响动物进食。另有部分学者在下颌升支处制造骨缺损模型，下颌升支骨壁较薄，植入植骨材料稳定性差，且下颌升支骨质与牙槽骨骨质在组织学上有区别，不能有效模仿牙槽骨缺损或牙周骨缺损。本课题组在下颌中切牙与第一磨牙之间的无牙区制作牙槽骨缺损模型，此位置手术不受开口度的限制，视野清楚，操作简单，不损伤颏神经，且基本不影响造模后动物的进食，能够较好地为骨移植材料在牙槽骨上的应用提供参考。

人类局部牙槽骨急性缺损后，血凝块充满缺损区，24 h机化，逐步被肉芽组织替代；3～4 d后肉芽组织向纤维组织转化；2周后骨缺损处骨小梁增生，进入机化的血凝块，缺损区底端最先有新骨新成；3个月后，新生骨基本长满缺损区，同时靠近软组织侧，软组织的增值导致凹形骨缺陷。本实验中骨缺损造模后自然恢复过程与人类局部牙槽骨缺损后的自然恢复过程类似，能较好地模拟人类局部牙槽骨缺损的修复过程。本实验中骨密度测量显示随时间推移，骨缺损处骨密度逐渐增高，12周时骨密度达最高但仍低于周围正常骨骨密度。因骨缺损处颊舌侧各有骨板阻挡，所以骨缺损处实际骨密度值要低于测量值，但各组动物均未排除此干扰因素，所以此干扰因素不影响各组的数据比较。碱性磷酸酶活性在第4周时达顶峰，说明成骨细胞在此阶段最为活跃，12周时仍较高，表明骨缺损处组织仍在向成熟骨组织改建中。

在兔下颌第一磨牙与中切牙中间的无牙区制造约4 mm×4 mm×4 mm缺损，所建模型全部成活，通过对每个时间点的监测，能够客观评价局部牙槽骨缺损后的自然修复过程。未来研究某种骨替代材料时，将其植入模型中，同样能够评价研究材料的性能；而且此种模型建立简单、评价客观。通过各项指标的检测，得出牙槽骨缺损自然愈合状况下的数据，为以后研究骨替代材料性能时提供参考；同时本实验将各种检测方法叙述清晰，可作为骨替代材料随时间修复效果检验的参考。

综上所述，本实验提出的在下颌第一磨牙与中切牙之间的无牙区制备牙槽骨缺损模型的方法，有操作简单、重复性强、便于材料植入、缺损底端为牙根面等诸多优点，为骨移植材料在牙槽骨缺损修复效果的评价奠定了基础。

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