FOXO1表达上调对骨肉瘤细胞增殖及凋亡的影响

任明亮，李辉，刘冬斌，陈国雄，谭镇南，刘鹄(南方医科大学附属南海医院，广东佛山528200)

骨肉瘤是起源于间叶组织的常见原发骨组织恶性肿瘤，大约占骨组织原发肿瘤的20%，好发于青少年，恶性程度高，易早期发生肺转移[1，2]。由于骨肉瘤的高侵袭性和转移性，患者预后较差。因此探索骨肉瘤的发生发展机制，寻找骨肉瘤基因治疗的有效靶点意义重大。叉头框(FOX)蛋白O是FOX蛋白家族中的一个重要的亚家族，包括FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6，在人体各种正常组织细胞中广泛表达，参与细胞分化、增殖、代谢、凋亡、信号传导、免疫等重要功能[3]。FOXO1基因定位于13号染色体13q13～14.1。研究发现，FOXO1在前列腺癌[4]、胃癌[5]、乳腺癌[6]、肝癌[7]等多种恶性肿瘤组织中表达下调，作为一种肿瘤抑制因子参与恶性肿瘤的发生发展。但目前有关FOXO1在骨肉瘤细胞中的表达变化及作用机制的研究较少。2017年6月～2017年9月，本研究探讨FOXO1表达上调对骨肉瘤细胞增殖及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 人骨肉瘤细胞系MG-63及人成骨细胞系hFOB1.19均购自美国ATCC公司。TRIzol Reagent和LipofectamineTM2000均购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒及qRT-PCR试剂盒购自日本Takara公司；FOXO1和GAPDH引物、包含FOXO1编码区的pcDNA3.1-FOXO1重组质粒和空载质粒由上海生工生物公司设计合成；一抗FOXO1和GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司，二抗购自武汉博士德生物公司；CCK-8试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所；Anexin-FITC/PI凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司。

1.2 FOXO1基因转染 人骨肉瘤细胞系MG-63、人成骨细胞系hFOB1.19均用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于5% CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养。取生长状态良好的对数生长期MG-63细胞，并随机分为FOXO1重组质粒组与NC组，采用LipofectamineTM2000按照说明书操作分别转染pcDNA3.1-FOXO1重组质粒和空载质粒。

1.3 MG-63细胞中FOXO1 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。转染后24 h，用TRIzol试剂提取两组细胞总RNA。取总RNA，按逆转录试剂盒说明书操作逆转录合成cDNA，低温保存备用。以cDNA为模板，参照qRT-PCR试剂盒说明书，应用实时荧光定量PCR 仪进行定量PCR检测。FOXO1 正向引物： 5′-AACCTGGCATTACAGTTGGCC-3′、反向引物：5′-AAATGCAGGAGGCATGACTACGT-3′，GAPDH 正向引物：5′-GGTGATGCTGGTGCTGAGTA-3′、反向引物：5′-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，共40个循环。用2-ΔΔCt法计算FOXO1 mRNA的相对表达量。

1.4 MG-63细胞中FOXO1蛋白表达检测 采用Western blotting法。转染后24 h收集两组细胞，蛋白裂解液提取细胞总蛋白，Bradford法行蛋白定量。各组取蛋白样品上样30 μg，行SDS-PAGE电泳分离，电转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭1 h，加入FOXO1(1∶500)一抗和GAPDH一抗(1∶1 000)，4 ℃过夜，洗膜后再加入二抗,室温孵育1 h，ECL显影液显影后凝胶成像仪曝光拍照，灰度扫描仪分析条带灰度值。FOXO1蛋白的相对表达量=FOXO1蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。

1.5 MG-63细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。转染后24 h取各组细胞接种于96孔细胞板，隔24 h向每孔加入CCK-8液10 μL，每孔设置4个复孔，并设置空白对照，于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育2 h，终止孵育后用酶联免疫检测仪测定各孔450 nm 波长处吸光度值。用吸光度值表示细胞的增殖能力。

1.6 MG-63细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。转染后48 h取各组细胞，制备1×106/mL的细胞悬液。每组取细胞悬液5 mL置于流式管中，依次加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 10 μL，混匀后室温下避光染色15 min，用流式细胞仪进行检测，计算细胞凋亡率。

2 结果

2.1 人骨肉瘤细胞中FOXO1 mRNA的表达 人骨肉瘤细胞MG-63和人成骨细胞hFOB1.19中FOXO1 mRNA相对表达量分别为0.21±0.10、1.02±0.04。FOXO1 mRNA在人骨肉瘤细胞MG-63中的相对表达量低于人成骨细胞hFOB1.19(P<0.05)。

2.2 转染后MG-63细胞内FOXO1 mRNA、蛋白表达变化 转染后24 h，FOXO1重组质粒组与NC组FOXO1 mRNA相对表达量分别为10.50±0.48、1.04±0.06，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)；FOXO1重组质粒组与NC组FOXO1蛋白相对表达量分别为1.98±0.22、0.19±0.09，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 FOXO1过表达对MG-63细胞增殖能力的影响 转染后48、72、96 h，FOXO1重组质粒组吸光度值分别为0.52±0.06、1.08±0.14、1.36±0.13，NC组分别为1.06±0.14、1.99±0.22、2.72±0.20，两组不同时间点吸光度值比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.4 FOXO1过表达对MG-63细胞凋亡率的影响 FOXO1重组质粒组、NC组细胞凋亡率分别为17.34%±1.04%、5.48%±0.38%，两组比较差异有统计学意义﹙P<0.05﹚。

3 讨论

FOXO1亦称FKH1或FKHR，是FOXO家族的重要成员之一，其转录活性受泛素化、磷酸化、乙酰化等途径调节，是PI3K、MAPK、IKK等信号转导通路中的关键信号分子[8]，在人体各种正常组织细胞中广泛表达，在机体细胞增殖、细胞凋亡和分化、抗氧化应激等多种重要的细胞功能调控中发挥重要的作用[9]。近年来研究发现，FOXO1表达降低与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。FOXO1在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥着抑癌基因的生物学功能[10]。陈宝英等[11]研究证实，FOXO1在乳腺癌组织中表达降低，FOXO1的表达变化与腋窝淋巴结转移、肿瘤大小密切相关。Wang等[12]在研究中发现，FOXO1在肝细胞癌组织中表达降低，通过影响核糖体、剪接体、类固醇的合成影响蛋白的合成，在肝细胞癌变和肝癌的发生发展中发挥重要作用。但目前有关FOXO1在骨肉瘤组织中的表达变化研究甚少，且作用机制尚未明确。本研究结果显示，FOXO1 mRNA在骨肉瘤细胞MG-63中的表达也较成骨细胞hFOB1.19降低，提示FOXO1低表达在骨肉瘤的发生发展中可能发挥重要的作用。

细胞无限增殖和凋亡受阻导致的增殖/凋亡平衡失衡是恶性肿瘤发生发展的重要机制[13]。近年来多项研究已证明FOXO1能够抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖，促进其凋亡，从而发挥着抑癌基因的作用。Li等[14]报道人肝癌细胞中水通道蛋白9能够抑制PI3K/Akt通路，上调细胞中FOXO1的表达，从而抑制癌细胞增殖并促进其凋亡。Zhao等[15]发现，姜黄素通过抑制PI3K/Akt通路激活FOXO1，诱导胰腺癌细胞凋亡。Yang等[16]在研究中发现FOXO1在肝细胞癌细胞中表达降低，miR-1269在肝细胞癌中表达增高，miR-1269通过抑制FOXO1的表达促进癌细胞增殖。本研究将重组质粒pcDNA3.1-FOXO1转染至骨肉瘤MG-63细胞，上调细胞中FOXO1的表达，结果显示转染后骨肉瘤细胞增殖能力下降。进一步通过流式细胞术检测转染后MG-63细胞凋亡情况，结果显示转染后骨肉瘤细胞凋亡率上升。以上提示在骨肉瘤细胞中FOXO1也起着抑癌基因的作用，上调FOXO1的表达能够抑制骨肉瘤细胞的增殖并促进其凋亡，抑制骨肉瘤的进展。

综上所述，FOXO1在骨肉瘤细胞中呈低表达，上调骨肉瘤细胞中FOXO1的表达能够抑制细胞增殖，促进其凋亡。这为骨肉瘤的靶向治疗提供了可能的有效靶点。

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