脑梗死和短暂性脑缺血患者肠道菌群、血清载脂蛋白E水平变化及其相关性

朱冬辰，朱彧，牛文彦

(1天津医科大学免疫学系，天津 300070；2天津市环湖医院/天津市脑血管与神经变性重点实验室；3天津医科大学代谢病医院)

脑梗死是一种致残率及病死率较高的疾病[1]。短暂性脑缺血发作被认为是脑梗死的先兆[2]。人体肠道微生态已被证明参与多种生理和病理过程，在心血管疾病中发挥重要作用[3]。脑梗死的发生发展与人体脂代谢紊乱具有密切联系[4]。载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是血脂的重要组成部分，参与动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、心脏病以及高血脂等疾病过程，其血清水平与脑血管疾病发生发展密切相关[5]。有研究[6，7]发现，肠道菌群结构和肠道功能紊乱可引起ApoE表达的增加，进而导致某些疾病的发生发展。但是，短暂性脑缺血和脑梗死患者肠道菌群微生物相对丰度、群落结构、微生物丰富程度的变化及其与ApoE表达的关系尚不清楚。本研究观察了脑梗死和短暂性脑缺血患者肠道菌群变化，并分析及其与血清ApoE水平的相关性，探讨肠道菌群紊乱与脑部缺血性疾病的关系，为脑血管疾病的发病机制研究提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本研究选取2015年5月～2017年10月天津市环湖医院收治的经头部CT检查确诊的脑梗死患者30例(脑梗死组)、短暂性脑缺血患者30例(短暂性脑缺血组)以及同期体检健康者30例(健康组)为研究对象。纳入标准：脑梗死组、短暂性脑缺血组均符合全国第四届脑血管病学术会议制定的诊断标准，并经头部CT检查确诊。健康组经体检证实无心脑血管疾病和血脂异常。排除标准：所有研究对象排除严重心肝肾功能不全者，排除近4周内接受降脂治疗者，排除全身感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、血液系统疾病以及其他系统血栓栓塞性疾病患者。研究对象年龄39～75岁，平均60.8岁，各组间性别和年龄有可比性(P均>0.05)。脑梗死组、短暂性脑缺血组发病24 h内留取粪便标本、血清标本，健康组统一留取粪便标本、血清标本。

1.2 主要试剂与仪器 粪便基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒(美国Illumina公司)，ApoE酶联免疫(ELISA)试剂盒(美国Abcam公司)，NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白浓度测定仪(美国赛默飞世尔科技公司)，MK3型酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)，120C离心机(北京白洋淀医疗器械有限公司)。

1.3 粪便菌群检测分析 取研究对象500 mg 中段粪便，采用粪便基因组提取试剂盒提取总RNA并对细菌16S rRNA基因V4可变区进行PCR扩增，V4上游引物5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′、下游引物5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR条件为94 ℃变性2 min，94 ℃、 30 s，52 ℃、 30 s，72 ℃、 45 s，共30个循环，72 ℃延伸5 min。采用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行基因组文库构建，通过HiSeq2500 PE250平台对细菌rRNA基因V4可变区进行测序，通过各样品测序数据对细菌物种间的亲缘关系和物种间的差异进行分析，获得细菌分类、细菌相对丰度(微生物相对丰度即一个样品里某一微生物种占所有微生物种的比例。根据生物的形态结构和生理功能可将生物划分为界、门、纲、目、科、属、种不同的等级)和细菌群落相互关系等信息。文库构建和测序工作由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.4 血清ApoE检测 血清ApoE检测采用ELISA法，酶标仪(吸收波长492 nm)记录光密度值(OD值)，根据OD值绘制标准曲线，根据标准曲线求出样本中ApoE的浓度。

2 结果

2.1 三组肠道菌群在门水平上最大相对丰度、群落结构(各组每个样本细菌种类和丰度)异质性和物种丰富程度比较 三组肠道菌群在门水平上最大相对丰度排前9位的依次为厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、疣微菌门、软壁菌门、放线菌门、蓝藻门、互养菌门和浮霉菌门，其相对丰度脑梗死组分别为0.423 2±0.219 3、0.298 9±0.124 1、0.238 4±0.113 8、0.001 4±0.000 8、0.011 2±0.008 1、0.021 5±0.002 4、0.001 0±0.000 2、0.000 2±0.000 1、0.000 1±0.000 0，短暂性脑缺血组分别为0.300 6±0.186 9、0.272 8±0.181 7、0.311 1±0.047 8、0.002 4±0.001 0、0.057 6±0.007 1、0.045 8±0.002 4、0.006 2±0.000 5、0.000 2±0.000 1、0.001 4±0.001 0，健康组分别为0.344 2±0.127 9、0.225 4±0.167 9、0.349 0±0.141 6、0.025 3±0.005 2、0.010 5±0.003 9、0.026 5±0.001 2、0.012 0±0.007 2、0.001 1±0.000 9、0.003 1±0.001 2；脑梗死组的拟杆菌门、疣微菌门、放线菌门、蓝藻门、互养菌门、浮霉菌门菌群相对丰度与健康组相比，P均<0.05；短暂性脑缺血组的疣微菌门、软壁菌门、放线菌门、蓝藻门、互养菌门、浮霉菌门菌群相对丰度与健康组相比，P均<0.05；脑梗死组的厚壁菌门、拟杆菌门、疣微菌门、软壁菌门、放线菌门、蓝藻门、浮霉菌门菌群相对丰度与短暂性脑缺血组相比，P均<0.05。

NMDS分析发现，健康组和脑梗死组肠道菌群群落结构异质性(胁迫系数stress<0.05，P<0.05)高于短暂性脑缺血组和健康组肠道菌群群落结构的异质性(胁迫系数stress>0.05，P>0.05)。

脑梗死组、短暂性脑缺血组、健康组肠道菌群的物种丰富程度即Chao1指数分别为591.775 5±198.472 2、778.844 5±71.197 9、799.345 5±69.689 0；脑梗死组与短暂性脑缺血组和健康组相比,P均<0.05；短暂脑缺血组与健康组相比，P>0.05。

2.2 三组血清中ApoE水平比较 脑梗死组、短暂性脑缺血组、健康组血清ApoE水平分别为(36.2±6.3) 、(33.2±5.4)、(32.8±5.7)mg/L；脑梗死组与短暂脑缺血组和健康组相比,P均<0.05；短暂脑缺血组与健康组相比，P>0.05。

2.3 三组在门水平上最大相对丰度排前9位的肠道菌群相对丰度与血清ApoE水平的相关性 三组拟杆菌门相对丰度与血清ApoE水平呈负相关(r=-0.606 8，P<0.05)，其他8种肠道菌群相对丰度与ApoE水平无显著相关性(r=0.3，P>0.05)。

3 讨论

脑梗死是一种脑血管循环障碍性疾病，短暂性脑缺血发作是由于短暂性脑血管血液供应不足引起的局灶性脑缺血，被认为是脑梗死的早期表现[8，9]。脑梗死和短暂性脑缺血等脑部缺血性疾病的发病和进展机制尚未完全清楚。

人体肠道菌群对维持人体的健康具有重要作用[10，11]。本研究发现，脑梗死和短暂性脑缺血患者肠道菌群主要微生物相对丰度、群落结构以及物种丰富程度均发生了一定变化。推测这一变化可能在脑血管疾病发生发展过程中扮演着重要角色，可能是脑部缺血性疾病的潜在致病因素[12]。

NMDS分析发现，脑梗死组与健康组肠道菌群的群落结构差异显著，同时脑梗死组肠道菌群多样性显著低于健康组，而短暂性脑缺血组和健康组肠道菌群多样性未见显著差异。上述结果表明肠道菌群的变化可能与脑缺血程度有关，进一步证实肠道菌群与脑部缺血性疾病的潜在联系[13]。ApoE是脑部缺血性疾病的独立风险因素之一，也是肠道菌群影响脑缺血和脑梗死发病过程的重要机制[14]。本研究也发现，短暂性脑缺血组和脑梗死组血清ApoE水平显著高于健康组，与文献[15]报道一致。已有研究[16]发现肠道微生态失调可导致人体代谢的紊乱。拟杆菌门是人体肠道菌群的主要组成之一，可受到遗传、年龄、饮食、疾病和药物等因素影响，具有调控人体脂代谢的功能[17]。本研究发现，拟杆菌门在脑梗死组患者粪便中相对丰度显著下调且下调水平高于短暂性脑缺血组，即拟杆菌门相对丰度与脑缺血程度有关。本研究还发现，健康组、短暂性脑缺血组和脑梗死组肠道菌群中拟杆菌门相对丰度与血清ApoE水平成负相关，而其他主要微生物种类与血清ApoE水平无显著相关性。因此，我们认为拟杆菌门可能通过调节ApoE代谢影响脑部缺血性疾病的发生发展。

对正常无菌小鼠喂食帕金森等患者肠道菌群可导致小鼠神经细胞发生改变，证明肠道菌群可以通过多种因素诱导疾病的发生[18]。根据本研究结果，也可以推测脑梗死患者饮食、代谢和其他原因导致了肠道微生态的改变，同时肠道微生态的改变也通过代谢等因素诱发或加重了脑缺血和脑梗死的发生或发展，形成正反馈，这需要在今后的研究中进一步证实。