HOTAIR lncRNA对垂体生长激素腺瘤侵袭及激素分泌的影响

陈岗，宋长明，李九州

(1宁夏回族自治区人民医院，银川750001；2寿光市中医医院；3滨州市人民医院)

垂体腺瘤是最常见的颅内原发肿瘤之一，其中10%～20%为生长激素腺瘤[1～3]。垂体生长激素腺瘤可分泌过量的生长激素并诱导生成胰岛素样生长因子-I(insulin-like growth factor I，IGF-I)作用于全身器官，导致巨人症、肢端肥大症、代谢障碍和循环呼吸系统疾病等[4～6]。部分垂体生长激素腺瘤具有侵袭性生长的特性，可累及海绵窦、颈内动脉等重要结构，手术风险大，全切除困难，术后易复发。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指长度超过200 nt、无蛋白编码功能的RNA，多数由RNA聚合酶Ⅱ转录生成。lncRNA可通过多种机制调控生物进程[7～9]。目前已发现lncRNA的异常表达与许多肿瘤的发生、发展密切相关。lncRNA中的HOX基因的反义基因间RNA(HOX transcript anti-sense intergenic RNA,HOTAIR)即HOTAIR lncRNA，被证实与乳腺癌、肝癌、结直肠癌等多种肿瘤的发生相关，并可作为某些肿瘤诊断和预后判断的一个重要标志物[10,11]。但其在垂体生长激素腺瘤发生发展和侵袭中的作用尚未明确。本研究观察了非侵袭性垂体生长激素腺瘤和侵袭性垂体生长激素腺瘤组织中HOTAIR lncRNA的表达变化，同时干扰垂体瘤细胞株GH3的HOTAIR lncRNA表达并观察其生长激素分泌及细胞侵袭性变化，探讨HOTAIR lncRNA对垂体生长激素腺瘤侵袭和激素分泌的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2010年1月～2017年10月在宁夏回族自治区人民医院和滨州市人民医院接受手术治疗的初治垂体生长激素腺瘤患者51例，男23例，女28例；年龄19～67(50.2±5.7)岁；其中侵袭性垂体生长激素腺瘤17例，非侵袭性垂体生长激素腺瘤34例。正常垂体前叶来源于5例组织捐献者，男3例，女2例，年龄30～59(37.2±4.6)岁；捐献者均无神经系统或内分泌系统疾病。垂体生长激素腺瘤组织和正常垂体前叶收集后保存于液氮中。本研究分别经宁夏回族自治区人民医院和滨州市人民医院伦理委员会批准。

1.2 细胞、试剂和仪器 垂体瘤细胞株GH3(为分泌过量生长激素的垂体瘤细胞)购于美国ATCC公司。TRIzol (Invitrogen，美国)、NanoDrop1000 (Thermo Scientific，美国)、第一链 cDNA 合成试剂盒(Invitrogen，美国)、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UD试剂盒(Invitrogen，美国)、ABI 7500 Fast system (Applied Biosystems，美国)、Lipofectamine 2000瞬时转染试剂(Invitrogen，美国)，Growth Hormone ELISA Kit (Abcam, ab108643，美国)。Transwell小室(Millipore，美国)。

1.3 垂体生长激素腺瘤组织和正常垂体前叶组织中的HOTAIR lncRNA mRNA检测 取约100 mg受检组织，TRIzol 提取总RNA，采用NanoDrop 1000明确其纯度和浓度，A260/A280和A260/A230接近2.0。采用Platinum SYBR Green qPCR superMix-UD试剂盒建立25 μL反应体系。HOTAIR lncRNA引物序列：正向(5′-3′)为GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC，反向(5′-3′)为ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC；内参GAPDH引物序列：正向(5′-3′)为GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，反向(5′-3′)为CGCTCCTGGAAGATGGTGAT。扩增调节：Hold stage为50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；Cycling stage为95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环；Melt curve stage为95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。HOTAIR lncRNA mRNA相对表达量以2-ΔCt(ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH)表示。HOTAIR lncRNA mRNA表达量高低以中位数为界。

1.4 垂体瘤细胞株GH3的HOTAIR lncRNA表达干扰、HOTAIR lncRNA mRNA及GH检测、细胞侵袭力观察 ①GH3细胞的HOTAIR lncRNA表达干扰：GH3细胞疏松贴壁培养于无酚红的、含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置5% CO2、37 ℃培养箱常规培养传代。取对数生长期GH3细胞进行后续实验。将GH3细胞随机分为对照组、阴性对照组和HOTAIR lncRNA siRNA组：对照组不作特殊处理，阴性对照组转染对照siRNA质粒，HOTAIR lncRNA siRNA组转染HOTAIR lncRNA siRNA质粒后，培养72 h。阴性对照siRNA的引物序列：正向(5′-3′)为UUCUCCGAACGUGCACGUTT，反向(5′-3′)为ACGUGACACGUUCGGAGAATT；特异性抑制HOTAIR lncRNA 的siRNA引物序列：正向(5′-3′)为AAAUCCAGAACCCUCUGACAUUUGC，反向(5′-3′)为UUAAGUCUAGGAAGCACGAAGC。②各组GH3细胞的HOTAIR lncRNA mRNA检测：方法同“1.3”。③各组GH3细胞培养液中生长激素检测：采用 Growth Hormone ELISA Kit (Abcam, ab108643)。按说明书设定标准孔和样本孔，分别加入不同浓度标准品50 μL和待测样本10 μL+稀释液40 μL，每孔各加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μL，空白孔不加。水浴，洗板，加底物(A、B各50 μL)，37 ℃避光孵育。加入终止液50 μL，孵育15 min，在450 nm波长处测定各孔的光密度(OD)值。根据标准品的OD值绘制线性回归曲线，按曲线方程计算各样本GH的浓度。④各组GH3细胞侵袭力观察：采用 Transwell小室实验。收集阴性对照组、HOTAIR lncRNA siRNA组的细胞，消化后重悬于无血清培养基，制成5×104/mL细胞悬液，将细胞悬液按每孔100 μL接种于预铺基质胶的8μm膜的Transwell小室上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h。取出Transwell小室，PBS清洗， 5%戊二醛固定，0.01%结晶紫染色。显微镜下随机计数5个视野的穿膜细胞数(穿膜细胞数越少代表细胞侵袭力越小)，每组细胞设立3个平行复孔，实验重复3次。

2 结果

2.1 垂体生长激素腺瘤组织和正常垂体前叶组织中的HOTAIR lncRNA mRNA表达比较 非侵袭性和侵袭性垂体生长激素腺瘤及正常垂体前叶组织中的HOTAIR lncRNA相对表达量分别为1.60±0.25、 3.27±0.57、1.00±0.00；非侵袭性和侵袭性垂体生长激素腺瘤组织中的HOTAIR lncRNA相对表达量与正常垂体组织相比，P均<0.05；侵袭性垂体生长激素腺瘤组织中的HOTAIR lncRNA相对表达量与非侵袭性生长激素腺相比，P<0.01。17例侵袭性垂体生长激素腺瘤患者瘤组织中HOTAIR lncRNA mRNA高表达13例、低表达4例，34例非侵袭性垂体生长激素腺瘤患者瘤组织中HOTAIR lncRNA mRNA高表达10例、低表达24例，两者相比，P<0.01。

2.2 阴性对照组、HOTAIR lncRNA siRNA组的GH3细胞HOTAIR lncRNA mRNA、生长激素表达量、细胞侵袭力比较 阴性对照组、HOTAIR lncRNA siRNA组的HOTAIR lncRNA mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、0.50±0.20，两组相比，P<0.01。阴性对照组、HOTAIR lncRNA siRNA组的生长激素表达量分别为(1.00±0.00)ng/mL、(0.64±0.15)ng/mL，两组相比，P<0.05。阴性对照组、HOTAIR lncRNA siRNA组的穿膜细胞数分别为(177±11)、(57±9)个/视野，两组相比，P<0.05。

3 讨论

垂体生长激素腺瘤是缓慢进展的疾病, 但往往可造成多器官功能损害，在人群中总发病率约70/100万，每年新发病例约2/100万[12]。由于垂体生长激素腺瘤生长隐匿、发展缓慢，在患病 4～10 a才能确诊，多诊断为大腺瘤和侵袭性腺瘤。侵袭性垂体生长激素腺瘤因侵袭海绵窦、颈内动脉、下丘脑等重要结构，手术风险极大，根治性手术难以实施，且术后易复发[13]。因此，侵袭性垂体生长激素腺瘤是临床治疗的难点。lncRNA的发现和功能学研究为肿瘤发病机制的探索提供了新的线索，也成为潜在的诊断标记物和治疗靶点。HOTAIR lncRNA是首个被发现以反转录调控基因表达的lncRNA，长度为2 185 nt，位于12号染色体HOXC11与HOXC12之间。尽管HOTAIR基因序列保守性差，且同源间存在较大差异，但发挥生物学功能的区段的基因序列和结构高度保守，可通过结合多梳蛋白调控相关基因的表达而发挥生物学作用[10]。2010年Gupta等[14]首次发现HOTAIR lncRNA在乳腺癌肿瘤组织及其转移灶组织中的表达水平较癌旁组织显著增高，且在转移灶组织中普遍偏高，多因素分析显示HOTAIR lncRNA高表达是预测患者转移及高死亡率的独立危险因素之一。Li等[15]在喉鳞状细胞癌的研究中发现，肿瘤组织中的HOTAIR lncRNA显著高于癌旁组织，且可作为一个独立的预后因素和潜在的治疗靶点。Yang等[16]对肝癌中HOTAIR lncRNA的表达进行了研究，发现肝癌组织HOTAIR lncRNA的表达水平显著高于癌旁组织，且与肝癌复发转移密切相关。体外研究也证实，下调HOTAIR lncRNA表达可显著提高肿瘤细胞对顺铂或柔比多星的敏感性，并促进肿瘤细胞凋亡，提示HOTAIR lncRNA可作为肝癌术后复发转移的一个潜在治疗靶点。Kogo等[17]在结直肠肿瘤中也进行了类似研究，发现肿瘤组织中的HOTAIR lncRNA表达水平显著高于癌旁组织，且其表达水平与患者预后呈正相关，多因素分析也说明HOTAIR lncRNA是患者生存期的独立的危险预测因子。此外， HOTAIR lncRNA的高表达亦可显著提高肿瘤细胞的侵袭能力。Gupta等[14]在体外研究发现高表达HOTAIR lncRNA显著增强乳腺癌细胞的侵袭性，而下调HOTAIR lncRNA表达则有效降低肿瘤细胞的侵袭能力。Geng等[18]研究发现与癌旁组织相比，肝癌组织中HOTAIR lncRNA的表达水平显著升高，且与肿瘤淋巴结转移存在显著相关性，提示HOTAIR lncRNA可作为肝癌患者有无淋巴结转移的独立预测因素。Nakagawa等[19]研究发现在非小细胞肺癌患者中，与原发性癌组织相比，脑转移瘤组织中的HOTAIR lncRNA表达水平更高，且体外研究证实HOTAIR lncRNA高表达可诱导肺癌A549细胞迁移。Niinuma等[20]发现HOTAIR lncRNA高表达与胃肠间质瘤患者的高风险等级及肿瘤转移、侵袭能力密切相关，体外研究也证实下调HOTAIR lncRNA表达则可抑制肿瘤细胞的侵袭能力。Kim等[21]同样发现HOTAIR lncRNA在胰腺癌细胞侵袭方面起着重要作用。

Gupta等[14]和Shi等[22]研究发现，HOTAIR与多梳蛋白抑制复合物(Polycomb repressive complex 2，PRC2)结合后作用于靶基因(包括JAM2、PCDH10等多个已知的抑癌基因)，导致H3组蛋白第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)和H3组蛋白第4位赖氨酸二甲基化(H3K4me2)，使该位点的碱基发生表观遗传学沉默，最终导致肿瘤的发生和转移复发。

在垂体瘤研究中，Li等[23]研究表明HOTAIR lncRNA的表达或与无功能垂体腺瘤的发展与侵袭有关。李九洲等[24]也指出下调内源性HOTAIR lncRNA的表达可有效地增强替莫唑胺引起的垂体腺瘤细胞凋亡。在此基础上，本研究就HOTAIR lncRNA对垂体生长激素腺瘤侵袭和激素分泌的影响进行了进一步的探索，结果表明HOTAIR lncRNA在垂体生长激素腺瘤的表达水平较正常垂体前叶明显增加，且侵袭性垂体生长激素腺瘤中的表达量较非侵袭性垂体生长激素腺瘤明显增加。由此推测HOTAIR lncRNA的高表达与垂体生长激素腺瘤的侵袭性密切相关。细胞实验进一步证实HOTAIRlncRNA siRNA转染的GH3细胞GH分泌水平和肿瘤细胞侵袭性较阴性对照组显著下降，由此推测HOTAIR lncRNA表达上调或可导致机体抗肿瘤效应缺失，进而导致肿瘤分泌功能和侵袭性增强。

综上所述，本研究发现垂体生长激素腺瘤组织中HOTAIR lncRNA mRNA表达异常，且该表达异常与肿瘤的侵袭性密切相关，提示HOTAIR lncRNA可作为识别侵袭性垂体生长激素腺瘤的新指标。在垂体瘤GH3细胞中，抑制HOTAIR lncRNA的表达可降低GH3细胞的侵袭性和GH分泌能力，但具体调控机制还需进一步研究。推测HOTAIR lncRNA可能是垂体生长激素腺瘤GH分泌水平和肿瘤细胞侵袭性的重要调控因素，随着对HOTAIR lncRNA功能研究的不断深入，其有望成为垂体生长激素腺瘤的治疗新靶点。