南阳野生乌头整株植物不同部位的生物碱和多糖含量比较研究＊

孙美玲，张 荳，杨 硕，彭诗涛，宋肖桦，刘 鹏，杜 红，李 飞，胡慧华

（北京中医药大学中药学院 北京 102488）

乌头，首载于《神农本草经》，列为下品，后有附子入药。乌头、附子分别为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的干燥母根及子根的加工品，中国药典2015年版中乌头其性热，味辛、苦，有大毒，归心、肝、肾、脾经，具有祛风除湿，温经止痛的功效，用于风寒湿痹，关节疼痛，心腹冷痛，寒疝作痛等症；附子性大热，味辛、甘，有毒，归心、肾、脾经，具有回阳救逆，补火助阳，散寒止痛的功效，用于亡阳虚脱，肢冷脉微，心阳不足等症[1]。汉代《金匮要略方论》提到乌头“熬，去皮，㕮咀，水煮去滓，内蜜再煎”。《伤寒论》[2]和《金匮要略》[3]中对乌头和附子的使用“炮或生，去皮，破八片”。《圣济总录》中提及“乌头蛤粉同炒裂，去皮脐”。《景岳全书》[4]中记载“面裹而煨”。张仲景及历代医家对乌头和附子的使用未提及去除须根，2015版《中国药典》[1]对乌头、附子的描述中均要求去除须根。

宋代由国家校正医书局的高保衡、孙奇、林亿编写的《伤寒论》序中谈及：“张仲景，南阳人，名机，仲景乃其字也。举孝廉，官至长沙太守。始受术于同郡张伯祖，时人言，识用精微过其师”[5]。张仲景最早使用附子，《伤寒论》[2]及《金匮要略》[3]使用乌头有20首，使用附子经方有33首。据考证，张仲景生活的年代大约为公元150-219年，具体出生地点在今河南省南阳，为南阳人，故本课题组赴河南南阳采集野生乌头整株植物进行研究。

生物碱和多糖是乌头、附子的主要有效成分[6,7]，生物碱其主要包括脂溶性生物碱和水溶性生物碱。脂溶性生物碱主要为双酯型和单酯型的酯型生物碱，水溶性生物碱包括一些微量生物碱如附子亭等。双酯型生物碱性质不稳定且毒性较大，易被水解，经一级水解失去一分子醋酸生成相应低毒的单酯型生物碱，再进一步水解生成几乎无毒的胺醇型生物碱[8]。乌头、附子都含有多糖，据研究报道，乌头多糖有降血糖作用[9]，附子多糖有显著的抑瘤作用、抗过氧化损伤、提高免疫力的作用[10,11]。欧水平等[12]从乌头各组织部位总碱与单酯、双酯型生物碱的比较可以看出，须根总生物碱含量很高，地上部分茎叶由于双酯型生物碱含量较低，毒性较子根、母根、须根小。曾荣等[13]检测到须根的总生物碱和双酯型生物碱含量明显高于附子且其所含淀粉、蛋白质较少，耐贮藏特性明显好于附子，说明了须根有较大的药用开发价值。

表1 流动相梯度洗脱条件

故本实验以3种单酯型生物碱（苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱）、3种双酯型生物碱（新乌头碱、次乌头碱和乌头碱）及总生物碱和多糖含量为指标，对南阳野生乌头、附子、须根、地上部分进行研究，探讨须根及地上部分的药用价值，欲为是否扩大乌头、附子药用部位提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

SB25-12DTDN型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；RE-2000A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；Waters2498高效液相色谱仪（DAD检测器、自动进样器、在线脱气、四元泵）；BT125D十万分之一分析天平（Sartorius）；pH902-Ad110pH计（泰州市正大科教仪器设备厂）；18系列紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。

1.2 试剂

新乌头碱（批号：110799-201106）、乌头碱（批号：110720-201111）、次乌头碱（批号：110798-201106）、苯甲酰新乌头原碱（批号：111795-201102）、苯甲酰次乌头原碱（批号：111796-201002）和苯甲酰乌头原碱（批号：111794-201303）对照品均购自中国食品药品检定研究院；D（+）无水葡萄糖标准品（20160913）、蒽酮、浓硫酸、无水乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃（德国Merck公司，色谱纯），其余试剂均为分析纯；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.3 药物

南阳野生乌头整株植物，2016年10月采挖于河南南阳。经中国食品药品检定研究院中药所张继主任药师鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的整株植物。

2 方法

2.1 生物碱含量的测定

2.1.1 生物碱测定色谱条件

采用药典法[1]，以乙腈-四氢呋喃（25∶15）为流动相A，以0.1 mol·L-1醋酸铵（每1 L含冰醋酸0.5 mL）为流动相B，按下表进行梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1；检测波长235 nm。流动相梯度洗脱条件（表1）。

2.1.2 对照品溶液的制备

取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱对照品适量，精密称定，加异丙醇—二氯甲烷（1∶1）混合溶液，制成每l ml各含苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱10 μg的混合溶液，制成每1 ml各含新乌头碱、次乌头碱、乌头碱5 ug的混合溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

分别精密称取南阳野生乌头、南阳野生附子、须根及地上部分的样品（过三号筛），约2 g，置具塞锥形瓶中，加入氨试液3 mL，加入异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，称定重量，超声处理（功率400 W，频率40 kHz，水温在25℃以下）30 min，放至室温，再称定重量，加异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液补足减失重量，滤过，量取续滤液25 mL，40℃以下回收溶剂至干，加入异丙醇-二氯甲烷（1∶1）3 mL溶解残渣，溶过0.45 μm微孔滤膜，为供试液[1]。

2.1.4 线性关系考察

分别吸取2.1.2项下的混合溶液2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 mL定容到10 mL容量瓶中制成不同浓度的对照品溶液，用0.45 μm微孔滤膜滤过。精密量取各浓度溶液10 μL注入高效液相中（表2）。

2.1.5 样品测定

分别精密吸取各供试品溶液10 μL按上述色谱条件进行检测。利用标准曲线（表2）计算各供试品中新乌头碱、乌头碱、次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱及苯甲酰次乌头原碱的含量（表3）。

表2 6种生物碱对照品溶液的标准曲线

表3 南阳野生乌头整株植物不同部位中6种酯型生物碱的含量平均值（n=4）（g/g）

2.2 多糖含量的测定

2.2.1 供试品溶液的制备

南阳野生乌头、南阳野生附子、须根及地上部分的样品各精密称取1 g，加入10 mL 95%乙醇回流提取2次每次2 h，弃去乙醇液，药渣挥干乙醇，加入40 mL纯水于90℃恒温水浴锅中浸提2次，每次2 h，滤过，滤液浓缩至一定体积，加95%乙醇使含醇量为80%，4℃冰箱中静置48 h，沉淀依次用乙醚、丙酮、无水乙醇洗涤2次，得粗多糖，将粗多糖溶于水，加水定容至250 mL，作为供试品溶液[14]。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密吸取浓度为0.0198 mg·mL-1葡萄糖对照品溶液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置于6支干燥的具塞刻度试管中，各加纯水补至2.0 mL，缓缓加入新鲜配制的0.2%硫酸－蒽酮试剂8.0 mL，摇匀，沸水浴10 min，取出，冰水浴冷却，放置10 min，以相应试剂为空白，于592 nm处测定吸光度，以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线得回归方程：Y=147.4901 × C-0.03722，R=0.9991。结果表明，葡萄糖在0.00198-0.0198 mg·mL-1内，线性关系良好。

2.2.3 多糖含量测定

精密吸取2.2.1项下各供试品溶液1 mL于具塞试管中，按2.2.2项下方法显色并测定吸光度，计算多糖含量。

图1 南阳野生乌头整株植物

图2 南阳野生附子

图3 南阳野生乌头

图4 南阳野生乌头和附子的须根

表4 南阳乌头整株植物不同部位中单、双酯和总酯型生物碱的含量平均值（n=4）（g/g）

图5 南阳野生乌头整株植物不同部位单酯型生物碱含量

图6 南阳野生乌头整株植物不同部位双酯型生物碱含量

图7 南阳野生乌头整株植物不同部位总生物碱含量

3 结果

3.1 性状

鲜南阳野生乌头植株，地下部分乌头、附子、须根是褐色，主根连着的是乌头，子根是附子（图1）。

南阳野生附子为圆锥形，长4-7 cm，直径3-5 cm。表面深褐色，顶端有印陷的芽痕，周围有瘤状突起的支根或支根痕（图2）。

南阳野生乌头呈不规则长圆锥形，质硬，略弯曲，长2-7 cm，直径0.6-1.8 cm。顶端有残茎和少数不定根残基，顶端一侧有一枯萎的芽，一侧有一圆形或扁圆形不定根残基。表面灰褐色或黑棕褐色，皱缩，有纵皱纹、点状须根痕及数个瘤状侧根（图3）。

南阳野生乌头附子的须根为褐黄色，长3-7 cm，直径0.1-3.0 mm，细长，柔软，主根和子根上均有生长。干燥的乌头须根黄褐色或褐色，卷曲，质脆，易折断（图4）。

3.2 南阳野生乌头整株植物不同部位活性成分生物碱含量对比

从单酯型生物碱含量分析可知，南阳野生乌头＞南阳野生附子＞须根＞地上部分（P＜0.05），含量比为2.48∶2.53∶1.79∶1。须根单酯型生物碱含量是南阳野生附子的72%，是南阳野生乌头70%；地上部分单酯型生物碱含量是南阳野生附子40%，是南阳野生乌头的39%。由实验结果可以看出须根单酯型生物碱含量仅次于南阳野生附子、乌头；地上部分单酯型生物碱含量不到南阳野生附子、乌头的1/2。

从双酯型生物碱含量分析可知，南阳野生附子＞须根＞南阳野生乌头＞地上部分（P＜0.05）,含量比为2232∶2129∶430∶1。须根双酯型生物碱含量是南阳野生附子的95%,是南阳野生乌头的4.95倍；地上部分双酯型生物碱含量是南阳野生附子的0.45%，是南阳野生乌头的0.23%。须根双酯型生物碱含量和附子相近，比南阳野生乌头双酯型生物碱含量还高出很多；地上部分双酯型生物碱含量较少。

从总生物碱含量分析可知，南阳野生附子＞须根＞南阳野生乌头＞地上部分（P＜0.05），含量比为30∶28∶8∶1。须根总生物碱含量是南阳野生附子的94%，须根总生物碱含量是南阳野生乌头的370%。地上部分总生物碱含量是南阳野生附子的3%，地上部分总生物碱含量是南阳野生乌头含量的13%。

3.3 南阳野生乌头整株植物不同部位活性成分多糖含量对比

南阳野生乌头不同部位的多糖含量：南阳野生附子＞南阳野生乌头＞地上部分＞须根（P＜0.05），含量比为2.52∶2.05∶1.19∶1。从单因素方差分析结果来看，须根多糖含量是南阳野生附子的40%，是南阳野生乌头的49%，是地上部分的84%。地上部分多糖含量是南阳野生附子的47%，是南阳野生乌头的58%，是须根的119%。

4 结论与讨论

分析对比结果可知，须根3种单酯型生物碱和3种双酯型生物碱含量均和南阳野生附子相近，有很好的药用价值。地上部分3种单酯型生物碱和3种双酯型生物碱含量相对其他部位很低，但是其所含3种单酯型生物碱含量满足2015版《中国药典》不得少于0.010%的规定，3种双酯型生物碱含量满足2015版《中国药典》不得过0.020%的规定，地上部分也有一定的药用价值。

须根、地上部分多糖含量约是南阳野生附子和南阳野生乌头的1/2，须根和地上部分多糖含量相近。吕永磊等[15]研究得须根中还含有甘露糖、鼠李糖、木糖是乌头和附子不含有的，须根多糖含量不同，其临床应用可能与乌头、附子也不同，有待结合药理进一步研究。地上部分多糖含量和须根相近，具体单糖组成及临床应用需进一步研究。

单、双酯型生物碱和多糖是乌头和附子的有效成分，本实验中南阳野生乌头须根部位中单、双酯型生物碱含量极高与南阳野生附子相近；南阳野生乌头地上部分中单、双酯型生物碱含量满足2015版《中国药典》中的要求；南阳野生乌头须根部位和地上部位的多糖含量约是乌头、附子的1/2，含量不及乌头附子高但是其单糖组成和临床应用有待研究。这些说明须根和地上部位有一定的药用价值，去除须根和地上部位会造成一定的资源浪费。通过南阳实地的采收发现，南阳江油须根在乌头附子表面分布很密集。目前人们对须根和地上部位的认识还不全面，张仲景对乌头附子药用过程中未有去除须根和地上部位的净制过程，所以对2015版《中国药典》中对乌头附子规定的去除须根还需从化学成分、生物活性、药理功效等做进一步的研究，以确定是否需要去除须根和地上部位。现在我们去除须根和地上部位的做法会造成一定的资源浪费。本研究对须根和地上部位的开发利用提供了有价值的参考。

表5 南阳乌头不同部位的多糖含量（g/g）

图8 南阳野生乌头整株植物不同部位的多糖含量