复方藜芍片通过阻断JAK2/STAT3通路抑制皮层神经炎症改善硝酸甘油致大鼠慢性偏头痛＊

杨建梅，邓海燕，李 坤，王星禹，陈 雷，李佳维，汝 芸，顾政平，徐 颖＊＊

（1.上海市徐汇区中心医院 上海 200031；2.上海中医药大学康复医学院 上海 201203;3.上海中医药大学生理教研室 上海 201203;4.中国科学院科学出版社 北京 100864）

1 前言

慢性偏头痛（chronicmigraine）是临床常见的原发性头痛，根据国际头痛协会最新发布的国际头痛分类和诊断标准Ⅲ试用版（ICHD-3beta版）慢性偏头痛诊断标准：头痛≥15天/月，至少持续3个月，头痛持续时间≥4小时/天，其中每月至少8次的头痛等临床症状[1]。在中国慢性偏头痛的患病率很高[2]，其发作不仅影响患者工作效率及生活质量，还给患者家庭带来沉重的经济负担[3]。目前临床上偏头痛特异性治疗西药包括麦角类制剂和曲普坦类，预防性治疗西药包括钙离子拮抗剂、抗癫痫药、抗抑郁药和5-HT受体拮抗剂等。这些药物虽然疗效显著，但是副作用较大，不能长期服用。如长期服用麦角类和曲普坦类药物会引起恶心、呕吐、心悸、烦躁等症状[4]。中医治疗头痛有其独特的理论和显著的疗效，且中药方剂毒副作用也小于西药。复方藜芍片是由上海市徐汇区中心医院研制，其主要中药包括：白芍、葛根、白蒺藜、丹参、白菊等，具有平肝潜阳、活血化瘀、镇痛镇静、解痉的作用，在临床应用多年，能明显缓解偏头痛疼痛程度和减少发作次数[5-6]。既往复方藜芍片曾命名为“颅痛饮”或“颅痛片”，按照《中国药品通用名称命名原则》，采用处方主要药材名称的缩写并结合剂型命名方法，因本品为复方制剂，“藜”是取主要药味“白蒺藜”，“芍”是取主要药味“白芍”，剂型为片剂，故命名为“复方藜芍片”。本研究目的在于观察复方藜芍片对慢性偏头痛大鼠皮层炎症、疼痛相关蛋白及JAK2/STAT3通路的调节作用，并探讨复方藜芍片改善慢性偏头痛的药理作用靶点，为其临床治疗提供科学依据。

2 材料

2.1 实验动物

60只SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠，体重200-220 g左右，上海中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005，实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2014-0008。动物自由摄食饮水，饲养在室温（21±2℃），湿度（45%-65%）和明暗交替（12 h：12 h）环境中，实验操作均严格按照实验动物伦理学相关规则进行，经上海中医药大学动物伦理委员会批准（审批号：SZY 201707015）。

2.2 主要试剂和仪器

复方藜芍片（批号：1703）由上海市徐汇区中心医院研制，上海百岁行药业有限公司生成；西比灵（批号：170313373）购自西安杨森制药有限公司；硝酸甘油注射液（批号：20161016）购自北京益民药业有限公司；anti-iNOS鼠单克隆抗体（批号：I0117）、anti-COX-2鼠单克隆抗体（批号：J2617）、anti-CGRP鼠单克隆抗体（批号：G1916）、anti-c-Fos鼠单克隆抗体（批号：L1916）、anti-JAK2鼠单克隆抗体（批号：D1216）、anti-STAT3鼠单克隆抗体（批号：C1317）、anti-p-STAT3鼠单克隆抗体（批号：G0816）、Anti-rabbit IgG（批号：09/2017）、Anti-mouse IgG（批号：08/2017）均购自 Santa Cruz Biotechnology公司；anti-p-JAK2兔单克隆抗体（批号：10/2017）购自Cell Signaling Technology公司；RIPA裂解液（批号：090717170930）购自碧云天生物技术公司；BSA（批号：6531010160）购自Geenview公司；Rat IL-1β ELISA KIT（批号：201710）购自美国RD公司；ECL显影液（批号：SD246946）购自Thermo Scientific公司；Rat TNF-α ELISA Set（批号：7192819EU）购自BD Pharmingen公司；电泳仪（美国BIO RAD，型号：BR90518）；全自动凝胶成像系统（上海天能公司，型号：Tanon-2500）；酶标仪（美国Bio-Tek，型号：Synergy2）。

3 实验方法

3.1 药物备制

复方藜芍片根据药品说明书显示：60 kg体重的成人每日用药8.4 g。根据“人体/动物体表面积计算法”换算，分别设低剂量（420mg·kg-1）、中剂量（840mg·kg-1），和高剂量（1680 mg·kg-1）。相同方法计算大鼠西比灵用量为1 mg·kg-1。复方藜芍片和西比灵分别用生理盐水溶解，配置好后冷藏于4℃冰箱备用。

3.2 动物分组及给药治疗

60只SD雄性大鼠，按随机数字表法分为6组：正常组（Control,n=10）、偏头痛组（Migraine,n=10）、复方藜芍片低剂量组（FFLSP-L，n=10）、中剂量组（FFLSPM,n=10）、高剂量组（FFLSP-H,n=10）和西比灵组（FH,n=10）。FFLSP-L、FFLSP-M、FFLSP-H组大鼠分别给予不同剂量的复方藜芍片溶液灌胃；FH组给予西比灵溶液灌胃；Control组、Migraine组分别给予等量生理盐水灌胃。各组灌胃均为每日1次，连续30天，灌胃容积均为0.1 mL·kg-1。

3.3 模型制备及标本处理

慢性偏头痛模型制作依据文献[7]，采用大鼠颈部皮下注射硝酸甘油溶液（10 mg·kg-1），每3日1次，共5次，造模时间为分别在各组大鼠给药治疗后的第18、21、24、27、30天，Migraine、FFLSP-L、FFLSP-M、FFLSPH组均需制备偏头痛模型，Control组大鼠颈部皮下注射等体积的生理盐水。造模成功的标志为注射硝酸甘油后的5 min左右，大鼠开始出现双耳发红、前肢频繁搔头、爬笼次数增多、烦躁不安等现象。最后一次造模24 h后处死大鼠，断头取脑后于冰上分离皮层并置于冻存管中，在液氮中迅速冷冻后转移至-80℃冰箱冷冻保存备用。

3.4 Western blot检测皮层蛋白表达

图1 复方藜芍片对慢性偏头痛大鼠皮层c-Fos、CGRP蛋白表达的影响

将皮层从冻存管中取出，加入裂解液（RIPA、PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，按100∶1∶1∶1的比例混合）于组织研磨仪中匀浆，4℃低温离心后取上清进行蛋白定量，将样品蛋白含量定为40 μg⋅μL-1进行上样。具体步骤如下：①配置10%SDS-PAGE凝胶（浓缩胶：超纯水2.1 mL；30%丙烯酰胺0.5 mL；pH 8.8 0.38 mL；10%SDS 0.03 mL；10%Aps 0.03 mL；TEMED 5 μL。分离胶：超纯水4.1mL；30%丙烯酰胺3.3mL；PH8.82.5mL；10%SDS 0.1 mL；10%Aps 0.1 mL；TEMED 10 μL）。②每孔上样10 μL。③60V电压电泳30 min，再80 V电压电泳30 min，110 V电压电泳直至结束。④110 V电压，4℃，转膜120 min。⑤5%脱脂奶粉或者5%BSA室温封闭1 h。⑥4℃孵育一抗过夜（分别孵育iNOS、COX-2、CGRP、c-Fos、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 抗体）。⑦TBST洗膜（10 min×3次，室温）。室温孵育二抗1 h。再次TBST洗膜（10 min×3次，室温）后均匀涂抹ECL显色剂进行曝光。

3.5 酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测皮层IL-1β、TNF-α含量

将皮层从冻存管中取出，加入200 mL 9%NaCl于组织研磨仪中匀浆，4℃低温离心后取上清进行蛋白定量。①1∶250稀释一抗后，100 μL/孔上样，4℃静置过夜（≥16 h）。②洗板，300 μL/孔×5次。③室温封闭1 h，洗板。④100 μL/孔的样本和标准品进行加样后，室温静置2 h，洗板。⑤1‥250稀释detection antibody后，100 μL/孔上样，室温静置1 h，洗板。⑥1∶250稀释Enzyme Reagent，100 μL/孔上样，室温静置 30 min，洗板。⑦100 μL/孔底物缓冲液，室温避光反应30 min。100 μL/孔终止液终止反应后，450 nm波长测OD值。

3.6 统计学方法

实验数据均使用平均值±标准误（Mean±SEM）表示，实验数据用SPSS18.0软件分析。多组间相比较采用One-way ANOVA分析方法，多重比较用LSD检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 复方藜芍片降低慢性偏头痛大鼠皮层c-Fos、CGRP的蛋白表达

Western blot检测各组大鼠皮层疼痛相关蛋白c-Fos和CGRP蛋白表达。与Control组比较，Migraine组大鼠皮层c-Fos和CGRP蛋白表达明显增高（P＜0.01）。与Migraine组比较，FFLSP-L、FFLSP-M、FFLSP-H、FH各组c-Fos蛋白表达均明显降低（P＜ 0.01）；与Migraine组比较，FFLSP-M、FFLSP-H、FH各组CGRP蛋白表达均明显降低（P＜0.01）；FFLSP-L组CGRP蛋白表达与模型组差异无统计学意义（P＞0.05）（图1）。

4.2 复方藜芍片降低慢性偏头痛大鼠皮层iNOS、COX-2的蛋白表达

Western blot检测大鼠皮层炎症因子iNOS、COX-2蛋白表达。与Control组比较，Migraine组大鼠皮层iNOS和COX-2蛋白表达明显增高（P＜0.01）。与Migraine组比较，FFLSP-L、FFLSP-M、FFLSP-H、FH各组iNOS和COX-2蛋白表达均明显降低（P＜0.01）（图2）。

4.3 复方藜芍片减少慢性偏头痛大鼠皮层IL-1β、TNF-α的水平

ELISA检测各组大鼠皮层IL-1β和TNF-α的水平，与Control组比较，Migraine组大鼠皮层IL-1β和TNF-α水平明显增高（P＜ 0.05）。与Migraine组比较，FFLSP-M、FFLSP-H、FH各组IL-1β水平均明显降低（P ＜ 0.01），FFLSP-L组IL-1β水平无明显差异；与Migraine组比较，FFLSP-L、FFLSP-M、FFLSP-H、FH各组TNF-α水平均明显降低（P＜0.05;P＜0.01）（图3）。

图2 复方藜芍片对慢性偏头痛大鼠皮层iNOS、COX-2蛋白表达的影响

图3 复方藜芍片对慢性偏头痛大鼠皮层IL-1β、TNF-α含量的影响

图4 复方藜芍片对慢性偏头痛大鼠皮层JAK2/STAT3信号通路的影响

4.4 复方藜芍片阻断偏头痛大鼠皮层JAK2/STAT3信号通路

Western blot检测各组大鼠皮层p-STAT3和p-JAK2蛋白的磷酸化水平。与Contral组比较，Migraine组大鼠皮层p-STAT3和p-JAK2蛋白表达水平明显增高（P ＜ 0.01）。与Migraine组比较，FFLSP-L、FFLSPM、FFLSP-H、FH各组p-STAT3和p-JAK2蛋白表达水平均明显降低（P ＜ 0.01）（图4）。

5 讨论

偏头痛是临床常见的原发性头痛，表现为发作性、搏动样头痛，常伴有恶心、呕吐、畏光或畏声，安静环境或休息后可缓解[8]。偏头痛病因复杂，发病机制目前尚不明确，关于其发病机制，主要存在以下几种学说：神经源学说、血管源学说、三叉神经血管反射学说、皮层扩散性抑制学说、脑的兴奋性假说及免疫因素等。其中较为公认的学说是三叉神经血管反射学说和皮层扩散性抑制学说。皮下或腹腔注射硝酸甘油溶液（10 mg·kg-1）已成为公认的偏头痛模型，硝酸甘油作为脂溶性分子可通过血脑屏障后产生大量的NO，NO具有强烈的扩张脑血管作用，并具有神经毒性作用，导致神经源性炎症反应，从而诱发偏头痛。我们采用大鼠颈部皮下注射间断多次注射硝酸甘油制作慢性偏头痛模型，类似临床的慢性偏头痛症状[7]。

复方藜芍片是徐汇区中心医院经过多年的临床实践中总结后拟出的治疗偏头痛（尤其是肝阳上亢型）的方药，经过大量的临床验证证明复方藜芍片在缩短头痛时间、预防头痛发作方面优于其他中药及西药，而且无明显毒副作用。复方藜芍片具有平肝潜阳、活血通络之功。其组成包括：白芍、葛根、白蒺藜、生丹参、白菊花、钩藤、珍珠母、蔓荆子、白芷、薄荷。方中白芍、葛根为君药，白芍柔肝止痛、平肝潜阳；葛根解肌退热，活血化淤，升引诸药上达头目。白蒺藜、丹参、珍珠母、钩藤、白菊花为臣药。白蒺藜平肝潜阳、舒肝解郁；丹参活血祛瘀；珍珠平肝潜阳，安神明目；钩藤清肝热，平熄肝风，有解痉之功；菊花疏散风热，清热解毒，平肝潜阳。佐以蔓荆子、白芷，蔓荆子散风热，清头目；白芷祛风散寒，通窍止痛。使药薄荷疏风清热，清利头目，善治头风头痛。诸药配合，具平肝潜阳、活血通络之功，有镇痛、镇静、解痉、扩张血管之效。有研究发现葛根主要成分葛根总黄酮能够明显改善利血平所致偏头痛症状[9]。其他研究发现白芍能够通过降低IL-1β、TNF-α，发挥抗炎作用[10]。研究发现菊花可以抑制环氧酶代谢途径，减少PGE2炎症介质的释放达到抗炎的目的[11]。这些研究都为复方藜芍片治疗偏头痛提供了一定的科学基础。

c-Fos原癌基因（cellular oncogene fos，c-Fos）属于即刻早基因。生理状态下，c-fos在中枢神经系统的表达很低，不易检测。当受到刺激的时候，在数分钟内会高水平表达，参与疼痛的控制[12]。降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptid，CGRP）是目前发现的最强大的血管舒张肽，CGRP在三叉神经系统中广泛表达，三叉神经系统兴奋时会释放大量CGRP，进而活化CGRP受体，扩张颅内血管，特别是硬脑膜血管，引起神经源性炎症的发生，产生头痛[13]。Deepak Kumar Bhatt等[14]通过在大鼠侧脑室注射CGRP以观察c-fos活化情况，发现在CGRP注射后的2 h，大鼠脑干外层，即神经胶质细胞和软脑膜中的c-fos表达增加，表明CGRP的高表达可能会激活c-fos基因。诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）在巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞和血管平滑肌等细胞中表达，IFN-γ、IL-6、NK-KB等细胞因子可诱导iNOS表达，催化产生NO引起炎症和疼痛反应。环氧合酶2（cycloxygenase 2，COX 2）是炎症过程中重要的诱导酶，可以被多种细胞因子诱导，能够促进前列腺素的生成[15]。JAK2/STAT3信号通路是多种细胞因子和生长因子在细胞内传递信号的途径，在生长发育过程中必不可少，但JAK2/STAT3通路的激活在炎症性疾病过程中也起着重要的调控作用。JAK2/STAT3的基本传递过程如下：细胞因子与受体结合后形成同型二聚体复合物，这种受体信号转导复合物的形成使得JAK2家族激酶相互接近发生反式磷酸化，并随后活化受体上的特定酪氨酸残基作为STAT3的停靠点，活化后的STAT3在胞质中形成同型二聚体，随后移位至细胞核促进相应的基因转录和表达[16,17]。

本次研究发现模型组大鼠皮层的促炎因子iNOS、COX-2、IL-1β、TNF-α，以及疼痛相关蛋白CGRP、c-Fos明显高于正常组，这与既往研究相一致，证明硝酸甘油一方面能刺激机体产生大量的IL-1β、TNF-α，诱导iNOS、COX-2表达引起炎症反应，从而引发头痛的发生；另一方面，硝酸甘油能够直接刺激皮层CGRP高表达，CGRP作为一种强大的内源性血管神经肽，能够刺激血管扩张，使头痛产生。与模型组比较，复方藜芍片中、高剂量能明显减少iNOS、COX-2、IL-1β、TNF-α、CGRP、c-Fos、p-JAK2、p-STAT3的表达。推测复方藜芍片的治疗作用可能从以下两个方面减轻头痛：①复方藜芍片能通过抑制JAK2/STAT3信号通路，减少IL-1β、TNF-α等炎症因子，降低iNOS、COX-2的表达，减轻由炎症所致的头痛。②复方藜芍片可以降低CGRP、c-Fos，抑制血管扩张，直接或间接减轻疼痛反应。综上所述，复方藜芍片中、高剂量能够明显减缓偏头痛，其机制可能是通过抑制JAK2/STAT3信号通路，减轻炎症反应，从而达到治疗慢性偏头痛的目的。