绵羊胚胎附植过程中相关因素的研究

孔维欢 ，代 蓉 ，万鹏程 ＊，石国庆 ＊

（1.石河子大学动物科技学院 832000；2.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所 832000）

胚胎附植是指哺乳动物由受精卵开始卵裂分化至囊胚阶段出现细胞定位，结束游离状态，并开始与母体子宫建立初步联系的一个过程，又称胚胎着床。它是妊娠建立的关键步骤，也是胚胎早期发育的重要环节。然而早期胚胎的附植又与肿瘤侵袭过程有极大的相似性，在母体子宫内膜的细胞表面能够发生定位、黏附、连接及侵入等[1]生理反应过程。一旦胚胎着床，胚泡及子宫内膜的形态结构就会随着生理状态的改变而发生变化。如：子宫内膜上皮细胞出现增殖分化，相邻上皮细胞之间发生融合，以及滋养层细胞与子宫内膜之间的融合等均能使得胚胎与子宫壁结合，进而与母体进行营养物质及遗传信息的交换与传递。这一点是保证了胚胎的正常发育、着床和妊娠。所以，胚胎的附植过程实质上就是胚胎与母体之间复杂而精细的多因子双向免疫调控的结果[2]。

1 绵羊胚胎附植早期迁移生长的过程

由于胚胎滋养层侵袭程度的大小，胚胎在着床时分为侵入型着床和非侵入型着床2种方式，其中羊、牛等反刍动物为非侵入型着床（图1）。但无论是反刍/非反刍型动物，所有哺乳型动物在完成胚胎附植的全过程都要经历胚胎自身发育迁移、附植窗口的准备、母胎识别、胚胎定位与黏附等4个阶段。

图1 非侵入型胚胎附植的时期变化

我们以绵羊胚胎为例，它的附植过程也大致分为囊胚的孵化、自身的伸长、与子宫内膜细胞的附植预接触，还有胚胎的定位与黏附等几个阶段。而囊胚的孵化就标志着胚胎与母体子宫的一种分子对话，开始密切的信号联系。通常在妊娠第6d形成胚泡，第8d囊胚突破透明带孵出，胚胎便吸取滋养层细胞的营养剧烈生长，发生形态学变化。妊娠第11d由球形变为管形，到第12d时长度可达10～22mm，到17d已达25cm以上[3]。其中妊娠的第14d，第1次出现双核细胞，它是胚胎附植的典型标志之一。但其功能尚未完全清楚，可能与合成催乳素、类固醇激素、妊娠蛋白等物质有关（图 2）。另外，在绵羊妊娠的第13d胚胎伸长的过程中滋养层细胞可形成指状形突起，紧接着第14～15d定位并初步附着于子宫，并在第17d左右发生黏附附植，绒毛不断生长至血管生成。同时合成分泌妊娠蛋白、类固醇激素等物质来调节母体生理内环境，至妊娠第21d附植基本完成。随后至第30d胚胎滋养层绒毛与子宫阜的组织形成“母包子型”胎盘[4]，指状突起也随之消失。

图2 绵羊胚胎附植迁移模式及与母体血浆激素水平

2 雌激素、孕激素与胚胎附植的关联

雌激素的分泌主要源于卵巢的颗粒细胞、黄体及胎盘，在雌性动物各个生长发育阶段都有一定的生理效应。在大多数哺乳动物正常发情期，雌激素浓度迅速升高，使得生殖道充血、输卵管分泌活动增强、子宫管状腺分泌增加，为促进卵泡发育、动物发情及子宫和阴道腺上皮增生平滑肌收缩等有利于动物交配、授精、妊娠等生理活动做准备[5]。但在反刍动物绵羊和牛中，还需孕激素的参与，如：生殖道受雌激素刺激发育后，只有经过孕酮（孕激素的一种活性物质，又称黄体酮 progesterone）的作用，才能发育得更加充分。所以，雌激素和孕激素是雌性动物生殖系统生长发育重要的性腺激素，在维持繁殖机能方面有重要的作用。尤其在胚胎附植期，雌激素起着重要的主导作用，刺激并维持雌性动物生殖道的发育。在奶牛、湖羊[6]、海门山羊[7]、波尔山羊[8]等诸多实验研究发现，发情周期分泌量呈周期性变化的雌激素与孕酮又呈负相关[9]，即子宫内膜增殖期主要分泌雌激素，分泌期时为孕激素，而后发情后期孕激素的分泌量又逐渐降低。

然而在正常的雌性动物体内，孕酮和雌激素在生殖系统方面不仅有拮抗作用，又有协同的作用，即少量孕酮与雌激素能够共同诱发动物发情行为。在动物体内，孕激素常以孕酮的生物活性最高，是雌雄激素生物合成的前体，属于具有独立生理功能的性腺类固醇激素。妊娠早期的子宫内膜功能主要是由卵巢分泌的孕酮及孕体分泌的IFN-t来调节[10]，其中孕酮在子宫内膜由增殖期到分泌期、子宫内膜基质细胞分化为蜕膜细胞及胚泡着床和早孕维持中有着重要的作用，也是胎盘形成必需的孕激素。诸如有研究显示，牛在排卵后孕酮量的升高与胚胎发育呈正相关[11-13]及受精和体细胞核移植后增加孕酮的量会提高胚胎的存活率[14-15]，但补充孕酮对牛和绵羊的妊娠率是没有任何影响的[16-17]。

综上在每个发情周期，子宫内膜都会在雌激素的预先作用下，孕酮促使子宫内膜增厚，刺激子宫腺增长，弯曲增多，分泌功能加强，抑制子宫的自发性活动，降低子宫肌层的兴奋作用（如对前列腺素和催产素的反应），从而保证胚胎的发育和着床，维持正常妊娠的状态。同时促使子宫颈口和阴道收缩，子宫颈黏液变黏稠，防止异物侵入，利于保胎，即胚胎附植过程中子宫分化到使胚胎着床的状态，就是雌激素与孕激素之间一种相互协调作用的结果。它们能够共同作用于子宫内膜腺体合成并分泌多种细胞因子及蛋白营养物质和前列腺素，促使子宫内膜处于最佳容受状态，为胚胎提供良好的附植环境[18]。

3 胚胎附植期分子免疫调控

胚胎着床的分子机制一直是生殖生物学领域的研究热点，随着人们对关键调控激素、调节因子以及信号通路等研究的不断深入，各类蛋白酶、细胞因子等非激素类分子在胚胎着床中的作用已得到广泛的关注。例如，胚胎着床期的子宫内膜处于经雌激素刺激后孕激素浓度较高的环境，这增强了趋化因子和细胞因子 LIF[19]、IL-1、IL-6[20]及 EGF[21]的表达，进而在胚胎附植过程中发挥重要的生物学作用，但是他们之间的一些调节机制并不是很清楚。

3.1 母-胎界面的免疫调节

从免疫学角度来讲，妊娠等同于同种异体移植，它的建立与维持取决于胚胎附植发育过程中母体蜕膜局部或全身的一种系统免疫耐受状态的变化，是一个相当复杂而又精确的过程[22]。母-胎界面免疫微环境中存在一种精妙的免疫平衡关系,一方面使得胎儿附植在宫内正常发育,另一方面适度活化抵抗病原体侵入，以防感染后蜕膜局部免疫系统发生改变而打破母胎间的免疫平衡,产生胎儿免疫排斥，引起胎儿早产、流产、畸形、生长发育受阻、子痫前期等妊娠病理疾病的发生。这种免疫平衡有赖于多种免疫细胞和细胞因子的参与及相互调节，对于维持正常妊娠起不可或缺的关键性作用。

例如，在维持正常妊娠上发挥着至关重要作用的子宫蜕膜基质细胞[23]就能够通过分泌多种细胞因子来营养胚泡、内分泌以及调控滋养层细胞的侵入，从而防止发生胎儿免疫排斥，保护胎儿的生长发育。研究发现，在妊娠这种母胎间复杂的免疫应答及免疫调节机制过程中Th1和Th2间的动态平衡显得尤为重要。如：正常的妊娠可依赖Th2型细胞因子（IL-6等）的免疫反应，而Th1型免疫及其相关细胞因子（IL-1β等）却能引起母胎界面炎性反应导致胎盘损坏、诱发流产，并且当Th2型细胞因子收到体外因素诱导下会向Th1型细胞因子转换而影响妊娠[24]。

LPS是诱发炎症反应的关键细胞毒性因子，对子宫内膜细胞有着双重作用，即低浓度可促进内膜细胞增殖，高浓度抑制内膜细胞生长且呈浓度依赖性[25]，会随着LPS剂量的增加加快细胞的凋亡。LPS还能够诱导粒细胞、子宫内膜细胞等合成和分泌多种细胞因子，引发繁殖障碍。尤昭玲[26]、金婉冰[27]等检测到流产或经LPS诱导的小鼠蜕膜中TNF-α、IFN-γ的浓度较正常妊娠小鼠中显著升高，而IL-4、IL-10表达则明显降低，说明炎症反应期间胎界面免疫反应偏离了Th2，倾向于Th1而易造成流产的结果。付灵梅等[28]研究发现正常的子宫内膜细胞在受到LPS培养液诱导后，急性炎症早期细胞因子TNF-α、IL-1β的分泌浓度随着作用时间增长呈上升趋势。所以，探究LPS引起子宫内膜细胞炎症损伤导致着床障碍机制中LPS参与免疫因子的调控机制，能够为治疗胚胎附植障碍提供理论依据。

3.2 TLR4与胚胎附植

TLR4作为一类天天免疫受体蛋白，与LPS识别结合参与炎症免疫反应，发生细胞的增殖与分化、迁移与凋亡及血管的生成有密切的关系。以前的研究显示TLR4参与小鼠[29]和人[30]的胚胎着床过程，表达于围着床期小鼠和人的蜕膜组织及蜕膜细胞，并且在小鼠的妊娠过程中LPS的诱导可调控TLR4基因及信号通路下游因子的表达，进而维持正常的妊娠，表明TLR4与胚胎附植有关。绵羊着床期间子宫内膜和胚胎的滋养层都发生胎滋养层细胞融合、子宫内膜上皮与滋养层的识别融合等，这些细胞形态的明显变化需要细胞内各种信号因子的协调作用来调控。同时，这些研究提示TLR4受体可通过相同的机制参与不同物种的胚胎着床。

结语

综上所述，反刍动物的胚胎着床和胎盘形成是一个复杂的生理过程，是妊娠建立的关键环节。目前可以说动物的胚胎移植、核移植克隆技术和转基因技术的发展障碍在于胚胎着床率低、出生率低。所以，提高胚胎工程技术的关键就在于提高胚胎工程操作胚胎附植着床的能力和动物的出生率，这也就提高了技术效率，降低了技术成本，其中潜在的经济意义自然就不言而喻了。因此，关于胚胎附植能力的研究、子宫发育到可接受胚胎状态的研究及胚胎与母体子宫间相互作用的研究是提高家畜妊娠能力和动物繁殖力的关键。同时这样的研究具有巨大的理论意义和潜在的经济价值。