芪贞增免颗粒质量标准提高

杜红娜 ，陆 安 ⋆，刘炳炜 ，李 芳 ，贾永兵 ，王晔娜 ，贺丙强 ，郭永红

（1.河北普德动物药业有限公司 050200；2.石家庄市兽用功能性添加剂工程技术研究中心 050200；3.河北维尔利动物药业集团有限公司 050200）

芪贞增免颗粒（商品名：红利来）收载于2012版《国家兽药标准汇编-兽药地方标准上升国家标准》第三册[1]，是由黄芪、淫羊藿和女贞子组成的，用于提高家禽、家畜免疫力，抗病毒。原国家标准中，只有黄芪和淫羊藿的薄层色谱（TLC）鉴别项，没有含量测定项。为更好的控制产品的质量，本研究在现有TLC鉴别的基础上，增加了含量测定项，通过试验研究，建立了黄芪多糖、特女贞苷和淫羊藿苷的含量测定方法，进行质量标准的提高。研究结果显示，方法可行且专属性较强，可更科学、全面地控制该制剂质量。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UltiMate3000高效液相色谱仪：蒸发光散射检测器，DAD检测器，变色龙工作站（赛默飞世尔科技有限公司）；AUW120D型电子天平（日本SHIMADZU公司）；101-1型电热鼓风干燥箱（龙口市电炉制造厂）。

1.2 试剂与对照品

黄芪甲苷对照品（批号110781-201713，质量分数97.4%），特女贞苷对照品（批号111926-201705，含量93.5%），淫羊藿苷对照品（批号110737-201405）上述对照品及对照药材均购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；纯净水。

1.3 药材

黄芪、淫羊藿和女贞子均购于亳州药材市场，经本公司质控部检验，均符合《中华人民共和国兽药典》[2]2015版（Ⅱ部）有关项下规定。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 黄芪的薄层鉴别

参考《中华人民共和国药典》[1]2015版（I部）黄芪药材的处理方法，使用三氯甲烷甲醇—水（13∶7∶2）的下层溶液为展开剂，对试验所用黄芪药材进行鉴别。见图1。

图1 黄芪TLC色谱图

2.1.2 淫羊藿的薄层鉴别

参考《中华人民共和国药典》[1]2015版（I部）淫羊藿药材的处理方法，使用乙酯丁酮—甲酸—水（10∶1∶1∶1）为展开剂，对试验所用淫羊藿药材进行鉴别。见图2。

2.2 黄芪甲苷含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈—水（33∶67）为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4500。

2.2.2 供试品及阴性样品溶液的制备

参考中国药典[1]中黄芪饮片项下的样品处理方法，供试品经过超声、萃取之后再通过D101型大孔吸附树脂（内径为1.05cm，柱高为12cm），用不同浓度的乙醇溶液洗脱，洗脱液蒸干后用甲醇定容，即得。按供试品制备方法制备不含黄芪的阴性样品，并按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。

图2 淫羊藿TLC色谱图

2.2.3 对照品溶液的制备

取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液，即得。

2.2.4 专属性考察

分别精密吸取对照品溶液、阴性样品溶液与供试品溶液各10μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，考察方法专属性。结果表明，阴性样品对测定无干扰，结果见图3。

图3 各成分HPLC色谱图

2.2.5 线性关系

称定黄芪甲苷对照品21.56mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL 的对照品贮备液，分别置于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即制备成浓度分别为0.0840m g·mL-1，0.1680mg·mL-1，0.2520mg·mL-1，0.3360mg·mL-1，0.4200mg·mL-1，0.5040mg·mL-1的对照品溶液。 分别精密量取 10μL 注入高效液相色谱仪进行测定。黄芪甲苷进样量的常用对数值作为横坐标，色谱峰面积常用对数值为纵坐标，建立线性回归回归方程：lgY=0.1329lgX+0.3824（r=0.9997），其中 X 为黄芪甲苷的进样量，Y为色谱图中黄芪甲苷峰的峰面积，结果表明黄芪甲苷进样量在0.840～5.040μg范围内线性关系良好。

2.2.6 重复性考察

取同一批样品（批次：20180301），按取样量0.5∶1.0∶1.5的比例分别取样，各平行3份，按供试品溶液制备方法制备，照上述色谱条件测定，计算黄芪甲苷的平均含量及含量的RSD值，考察方法的重复性。测得黄芪甲苷平均含量为0.52mg·g-1，RSD值为1.73%，重复性良好。

2.2.7 精密度考察

取同一供试品溶液连续进样6次，分别记录色谱峰峰面积并计算峰面积的RSD值。测得黄芪甲苷色谱峰峰面积RSD值为0.36%，精密度良好。

2.2.8 稳定性考察

取同一供试品溶液，分别于 0h，4h，8h，12h，18h 和 24h 进样分析，分别记录黄芪甲苷峰面积并计算峰面积的RSD值。测得黄芪甲苷色谱峰峰面积RSD值为0.68%，供试品溶液在24h内稳定。

2.2.9 准确度考察

取同一批样品（批次：20180301）2.5g，平行9份，分别精密加入高、中、低3个浓度的黄芪甲苷对照品溶液，每个浓度平行3份，按确定的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果见表1。

表1 黄芪甲苷加样回收率试验结果（n=9）

上述结果表明：9份供试品溶液中，黄芪甲苷的回收率均在98%～102%之间，回收率平均值为100.39%，RSD值为1.09%（n=9），回收率良好，准确度符合要求。

2.3 特女贞苷和淫羊藿苷含量测定

2.3.1 色谱条件色谱柱

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈—水； 流速：1.0mL·min-1； 检测波长 0～30min 为 224nm，30～50min为 270nm。 柱温：35℃；进样量：10μL；梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序

2.3.2 供试品及阴性样品溶液的制备

取本品1g，置50mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，即得。按供试品制备工艺制备不含女贞子和淫羊藿的阴性样品，并按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。

2.3.3 对照品溶液的制备

取特女贞苷、淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1mL含特女贞苷、淫羊藿苷各150μg的混合对照品溶液，即得。

2.3.4 专属性考察

分别精密吸取对照品溶液、阴性样品溶液、供试品溶液各10μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。结果表明，阴性样品无干扰，结果见图4。

2.3.5 线性关系考察

称取特女贞苷和淫羊藿苷对照品各10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液0.5，1，2，3，6mL，分别置25mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀，配制成系列浓度的混合对照品溶液。各精密量取10μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以特女贞苷和淫羊藿苷浓度为横坐标（X，μg·mL-1），色谱峰峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得回归方程分别为：特女贞苷：Y=0.199X+0.0341，（r=1），淫羊藿苷：Y=0.1537X-0.2736，（r=0.9997），分别在 10.0012～250.0300μg·mL-1、10.0185～250.4625μg·mL-1范围内成良好线性关系。

2.3.6 重复性考察

取同一批样品（批次：20180301），按取样量 0.5∶1.0∶1.5的比例分别取样，各平行3份，按2.3.2方法制备供试品溶液，照上述色谱条件测定，特女贞苷和淫羊藿苷平均含量分别为6.20mg·g-1和 3.25mg·g-1，RSD 值为分别为 1.21%和 1.33%，该方法重复性良好。

图4 各成分HPLC色谱图

2.3.7 精密度考察

取同一供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，分别记录特女贞苷和淫羊藿苷色谱峰面积，计算峰面积的RSD值。特女贞苷和淫羊藿苷色谱峰峰面积RSD值分别为0.47%和0.23%，精密度良好。

2.3.8 稳定性考察

取同一供试品溶液，分别于 0h，4h，8h，12h，18h 和 24h 进样分析，记录特女贞苷和淫羊藿苷峰面积，计算峰面积的RSD值。特女贞苷和淫羊藿苷色谱峰峰面积RSD值分别为0.28%和0.37%，供试品溶液在24h内稳定。

2.3.9 准确度考察

取同一批样品（批次：20180301）2.5g，平行 9份，分别精密加入高、中、低3个浓度的特女贞苷和淫羊藿苷混合对照品溶液，每个浓度平行3份，按2.3.2方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定。结果见表3。

上述结果显示：9份供试品溶液中，特女贞苷的回收率均介于98%～102%之间，回收率均值为100.56%，RSD值为1.28%（n=9），该方法回收率良好。9份供试品溶液中，淫羊藿苷苷的回收率均介于98%～102%之间，回收率均值为99.80%，RSD值为1.01%（n=9），该方法准确度符合要求。

表3 各成分加样回收率试验结果（n=9）

3 讨论

本研究参考药典[1]方法，完成黄芪和淫羊藿TLC鉴别；同时，对“女贞子”的鉴别进行了研究，初步摸索发现阴性样品存在干扰，调整展开剂系统及供试品溶液制备方法［3-6］后，均未得到理想检测结果。查阅文献［7］后得知，淫羊藿中存在齐墩果酸成分，与女贞子中的成分有重合，这可能是造成阴性干扰的原因之一。此项鉴别方法还有待进一步深入研究，故未载入质量标准。

中药复方制剂成分复杂，仅通过薄层鉴别进行产品的质量控制，或仅以单种成分含量为质量标准，均不能全面体现制剂的整体质量情况，也不能对制剂的质量进行控制。随着科学技术的发展和分析技术的提升，中药复方的质量标准中绝大部分都加入了含量测定项，且由单一指标性成分检测向多组分检测发展［8］。在芪贞增免颗粒中，黄芪甲苷、黄芪多糖、淫羊藿苷和特女贞苷分别为黄芪、淫羊藿和女贞子中的主要活性成分，对于疾病的治疗也起到了主要作用，因此，本研究拟建立黄芪甲苷、黄芪多糖、特女贞苷和淫羊藿苷四种成分的含量测定方法。但在参考文献［9］进行紫外分光光度法测定黄芪多糖含量研究过程中发现，阴性存在干扰，该方法专属性较差。通过对辅料的筛选及制剂工艺的反复摸索试验，均未得到较好的结果，阴性依然存在干扰。分析原因，可能是辅料大部分为单糖、双糖或多糖类成分所致。因此含量测定项未加入黄芪多糖的含量测定，下一步科研有待深入研究。

通过参考药典及黄芪甲苷含量测定文献［10-12］、淫羊藿苷和特女贞苷含量测定文献［13-15］，本研究建立了HPLC-ELSD测定黄芪甲苷含量的方法，HPLC同时测定特女贞苷和淫羊藿苷含量的高效液相色谱法。对特女贞苷、淫羊藿苷对照品进行全波长扫描时发现，前者在224nm有最大吸收，后者在270nm有最大吸收，同文献［15］结果一致，故确定检测波长为224nm和270nm，采用波长切换HPLC同时测定特女贞苷和淫羊藿苷的含量。

芪贞增免颗粒原有标准中仅有对黄芪和淫羊藿的薄层鉴别项，没有含量测定项，原有标准不够完善。为了建立一种准确、可行且具备普遍适用性和规范性的芪贞增免颗粒的质量标准，笔者进行了较全面的试验研究，并依据 《中华人民共和国药典》2015年版Ⅳ部通则9101“药品质量标准分析方法验证指导原则”进行了较细致的方法学验证，证明方法准确可靠，专属性高，可为芪贞增免颗粒制剂提供有效的质量控制方法。黄芪甲苷、特女贞苷和淫羊藿苷含量测定方法的建立，提高了产品质量标准，为芪贞增免颗粒质量标准的提升，提供了参考依据。