基因修饰干∕祖细胞在心肌梗死后心脏血管再生中的研究进展

陶嘉萍 黄锋 黄伟强

广西医科大学第一附属医院老年心内科&广西心脑血管疾病防治精准医学重点实验室培育基地&广西心脑血管疾病临床医学研究中心（南宁530021）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）主要是指冠状动脉粥样硬化斑块破裂引起血栓形成，导致相应冠状动脉堵塞、血流中断，一部分心肌因严重的持久性缺血而发生局部坏死的疾病。血管再生和心肌组织血管化是影响心肌梗死预后的重要因素。干∕祖细胞是一类具有自我复制和分化能力的细胞，不少研究将其用于MI 后的血管再生治疗研究，取得了一定效果。各种基因工具可用于介导效应分子促进血管再生［1］，其中，基因修饰干∕祖细胞用于血管再生治疗备受关注，其方法是利用基因工具合成与血管生成相关的目的DNA 或RNA 片段，再经载体导入宿主细胞，调节宿主细胞目的基因表达，从而实现在基因水平调节血管再生的目的。

1 血管再生治疗相关干/祖细胞类型及其功能

干∕祖细胞的内皮分化潜能及其旁分泌效应在血管再生治疗中起重要作用。研究发现，内皮细胞（endothlial cell，ECs）可以由成体干∕祖细胞、胚胎干细胞［2］、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）［3］分化而来。其中，成体干∕祖细胞包括心脏干细胞（cardiac stem cells，CSCs）［4］∕心脏祖细胞（cardiac progenitor cells，CPCs）［5］、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）［6］、脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）［7］和心血管祖细胞［8］等。干∕祖细胞的旁分泌效应能增加驻留在心脏的干∕祖细胞的存活率，促使梗死心肌组织血管新生，调节免疫应答，募集内源性干∕祖细胞并促进有益的心脏重塑，从而改善心功能。如ADSCs 能通过旁分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、基质细胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1，SDF-1α）和单核细胞趋化蛋白（monocyte chemotactic protein-3，MCP-3）促进血管生成和趋化［9］。

2 参与调节血管再生的基因

2.1 编码基因 机体内参与调节血管生成的编码基因包括：（1）抗凋亡基因：丝∕苏氨酸激酶Pim1 编码基因［10］、抗凋亡因子Bcl-xL 编码基因［11］、热休克蛋白27（heat shock protein 27，Hsp27）编码基因HSPB1［12］等。（2）促进血管生成基因：VEGF 编码基因［13］、胰岛素样生长因子（insulinlike growth factor-1，IGF-1）编码基因［14］、HGF 编码基因［15］和心血管祖细胞LIM-homeobox 转录因子islet-1 编码基因ISL1［16］等。（3）抗炎相关的基因：肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）编码基因、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）编码基因和白介素-6（interleukin-6，IL-6）编码基因［17］等。（4）促进细胞靶向归巢的基因：SDF-1a 编码基因和MCP-1 编码基因［18］、趋化因子GCP-2 编码基因和趋化因子NAP-2 编码基因［19］等。（5）其他编码基因，如整合蛋白β1（integrin β1）编码基因Itgb1［20］和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）编码基因［21］等。

2.2 非编码基因 非编码RNAs（non-coding RNAs，ncRNAs），包括微小RNAs（microRNAs，miRNAs）、长链非编码RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）和环状RNAs（circular RNAs，circRNAs）。

MiRNAs 是一类由19～23 个核苷酸组成的小分子单链ncRNAs，是发夹结构的约70～90 个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer 酶加工后生成。miRNAs 在细胞内具有多种重要的调节功能，是研究最为广泛的参与调节血管再生的非编码基因。在MI 的研究中，已经发现miR-130 与急性MI 的炎症反应和心肌纤维化相关［22］；ECs 特异性miR-126可介导体内血管生成和发育并维持血管的完整性［23-24］；miR-210 可促进心肌细胞增殖和存活，促进小鼠MI 后的血管生成，减少心肌凋亡，改善心脏功能［25］。此外，DONG等［26］发现，调节细胞衰老的miR-10a，不仅可以提高衰老的MSCs 的分化能力，还可以促进移植后MSCs 的存活，通过激活Akt（蛋白激酶B）诱导血管生成因子的表达，促进MI 小鼠心肌组织中血管再生。

随着高通量测序技术的广泛应用，越来越多lncRNAs和circRNAs 被发现。lncRNAs 是一类长度大于200 个核苷酸的长链ncRNAs，在顺式或反式转录调控、核结构域组装和调控RNA 和蛋白质功能等方面发挥重要作用［27］。circRNAs 是主要由外显子环化而成的具有环状闭合结构的一类新型RNA，可作为miRNAs 海绵或基因剪切和转录的调节因子调节基因表达［28］。

lncRNAs 和circRNAs 在心血管疾病，特别是在MI 中的研究仍处在起始阶段。lncRNA MIAT（myocardial infarction associated transcript，MIAT）是心肌梗死相关转录本，虽然MIAT 在心肌梗死中发挥的作用尚不清楚，但有证据表明MIAT 通过MIAT-（MiR-150-5P）-VEGF 反馈环调控ECs 的功能［29］。组织缺氧是血管生成的强烈诱因，有研究显示，lncRNA linc00323 和MIR503HG 在ECs 中有强烈的缺氧依赖性激活现象，在缺氧环境它们被激活并调控内皮转录因子GATA2 的表达，从而调控ECs 的增殖和管状形成［30］。此外，在糖尿病视网膜血管病变中，circRNA circHIPK3 能阻断miR-30a 功能，导致视网膜血管ECs 过度增生，血管功能紊乱［31］。这些研究提示，ncRNAs 能通过不同途径参与血管再生的调控，为其今后用于MI 后心肌血管再生治疗提供了依据。

3 基因修饰的载体和干/祖细胞的治疗途径

目前常用的基因修饰载体包括病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体的转染方式有腺病毒、腺相关病毒和慢病毒转染，非病毒载体的转染方式有电穿孔、脂质体和纳米微粒体转染等。在干∕祖细胞治疗MI 的研究中，其治疗途径主要有全身（静脉内）注射和局部（心肌内）移植两种［32］。与静脉注射相比，心肌内移植的效果主要依赖干∕祖细胞的归巢能力和滞留能力，静脉注射虽比心肌内移植途径容易实施，且侵入性小，但注射的干∕祖细胞容易在肝、肺和脾脏中积累，仅少量能经过血液循环到达缺血的心肌组织。因此，直接心肌内注射这种治疗途径目前是研究MI 的干∕祖细胞治疗的首选方法。

4 基因修饰干/祖细胞促进MI 后血管再生的机制

4.1 增强干/祖细胞活性 基于干∕祖细胞的血管再生疗法是MI 治疗中备受关注的新型治疗方法，但梗死心肌组织中因缺血引起的强烈炎症反应和氧化应激反应可产生过量的细胞凋亡因子，导致移植后的干∕祖细胞凋亡增加，存活减少，进一步影响干∕祖细胞功能的正常发挥。研究发现，移植到MI 小鼠心脏中的干细胞，一周内死亡率高达90%［33］，可见，直接将干∕祖细胞移植到梗死区域并不能达到理想的治疗效果。

有研究人员通过对移植前的干∕祖细胞进行基因修饰预处理，试图提高它们移植后的活力。HGF 是血管生成、抗炎和抗细胞凋亡相关的重要细胞因子，ZHU 等［34］通过孔介二氧化硅纳米颗粒生物相容性系统将HGF 基因导入骨髓MSCs（HGF-MSCs），再移植到MI 大鼠心肌缺血部位，结果显示，移植后HGF-MSCs 的存活率较MSCs 高，且HGFMSCs 移植后心肌细胞凋亡显著减少、间质纤维化减轻、心肌血管生成增加。此外，组织抗炎因子IL-10 在MI 模型中的心脏保护作用也已经得到证实，有报道［8］，在IL-10 敲除的急性MI 小鼠体内miR-375 水平显著升高。为研究IL-10和miR-375 在MI 过程中的内在联系，移植前敲除骨髓血管生成祖细胞（bone marrow-derived angiogenic progenitor cells，BMPAC）的miR-375 基因，发现抑制miR-375 表达能明显改善移植后BMPAC 的存活率，并提高由BMPAC 旁分泌效应介导的MI 后新生血管的形成和组织修复能力。进一步研究发现，沉默miR-375 上调了3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1 的表达，并通过激活PI3K∕Akt 信号通路，提高BMPAC 在MI组织中的存活率和功能。另有报道［35］，硫氧还蛋白（thioredoxin-1，Trx-1）有强效抗氧化特性和生长、转录调节功能，使用腺病毒携带能编码Trx-1 的基因转染到大鼠MSCs（Trx-1-MSCs），再注射到MI 大鼠心脏缺血边界区，移植4 天后与对照组相比，Trx-1-MSCs组的血红素加氧酶-1和VEGF 表达明显升高，因此提高Trx-1-MSCs 移植后的抗缺氧能力和存活率，并促使毛细血管生成增加。

4.2 动员干/祖细胞迁移至缺血区 趋化因子SDF-1 通过与C-X-C 趋化因 子受体4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）和CXCR7 结合，激活下游信号级联反应，调节心肌血管再生过程中CSC 的动员、募集和功能［36］。ZUO等［37］通过体外实验证明，用c-kit＋配体干细胞因子（c-kit＋ligand stem cell factor，SCF）刺激能提高CSC 迁移能力，使用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制CSC 中CXCR4 的表达后，SCF 的作用被抑制，并发现该作用是SCF 通过诱导CXCR4-serine399 磷酸化进行调节，而G 蛋白偶联受体激酶6（transmembrane-spanning G protein-coupled receptor kinase 6，GRK6）在这个环节中起着关键的信号传导作用。基于体外研究的结果，在MI 模型中，作者用体内示踪方法研究siGRK6-CSC（siRNA 抑制CSC 中GRK6 的表达）和CSC 移植后的易位和归巢情况，结果显示，部分CSC可以易位和归巢到心肌损伤部位，而siGRK6-CSC 却没有观察到类似现象。此外，有研究报道CXCR4 过表达可增强MSCs 表达VEGF、细胞周期蛋白A2 和转化生长因子β2，而缩短MSCs 细胞周期，增加其内源性再生能力。在MI 大鼠体内，CXCR4 过表达能在更大程度上动员MSCs 迁移到心肌缺血区域，并通过旁分泌信号传导机制促进缺血区的血管生成［38］。

整合素连接激酶（integrin-linked kinase，ILK）是一种在心脏高表达的丝氨酸∕苏氨酸激酶，可通过其下游Akt 信号促进细胞增殖、分化、迁移和粘附，是血管生成的重要调节因子。有研究用腺病毒介导ILK 基因转染CPCs（ILKCPCs），结果显示，过表达ILK 能增加体外CPCs 的增殖和迁移，增加CPCs 移植到MI 大鼠体内后的存活率，促进心肌微血管再生［39］。另有学者将ILK-MSCs 注射到MI 大鼠心肌梗塞边界区，观察到ILK-MSCs 移植后的存活率明显提高，研究证明ILK 可通过Akt 和mTOR 信号通路增加VEGF 的表达，促进梗死区新生血管生成［40］。

4.3 促进干/祖细胞向内皮细胞分化 机体缺血性损伤会启动多种促进受损组织血管再生的机制，理论上这种促使血管生成的环境应该诱导血管祖细胞向ECs 分化，但实际上很少有血管祖细胞被招募进入血管系统并分化显示出ECs 表型。在MI 后血管再生治疗中，为提高血管祖细胞的内皮分化效率，获得足够数量的功能性ECs，以提高MI 后心肌血管再生治疗的疗效，XU 等［41］最近报道，E2F 转录因子1（E2F transcription factor1，E2F1）通过促进糖酵解途径中的丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）的表达，抑制骨髓祖细胞（bone marrow progenitor cells，BMPC）从无氧糖酵解到线粒体氧化磷酸化代谢的转变，进而抑制BMPC 的活化，抑制BMPC 向ECs 分化。他们研究发现，在E2F1 缺陷型小鼠体内，PDK 的表达明显下降，将从E2F1 缺陷型小鼠体内分离出的BMPC（BMPCE2F1-∕-）注射到MI 小鼠体内，观察到E2F1 缺失可促进缺血心肌组织中的BMPCE2F1-∕-向ECs 分化，促使血管生成增加；为明确PDK 在BMPC 向ECs 分化过程中的作用，他们进行体外实验研究，结果证明BMPC 中PDK 的过表达抑制了BMPC 的氧化代谢，降低内皮分化能力。

由体细胞重编程得到的iPSCs 具有无限的自我更新能力，能分化产生大量所需的功能性细胞，因而成为一类重要的再生医学研究的干细胞类型。目前，不少研究将iPSCs分化而来的ECs 用于血管再生治疗，但其自发性ECs 分化率低是未来临床研究的主要阻碍，因此，如何提高干细胞的内皮分化效率是个亟待解决的问题。以往介导血管发育的信号传导途径为建立有效的iPSCs 的ECs 分化体系提供了重要信息，近期研究报道，LIANG［42］等将携带拮抗血管生成的miR-495 基因的病毒转染到iPSCs（iPSCsAnti-495）中，能提高iPSCsAnti-495诱导分化为ECs（iPSCAnti-495-ECs）的能力。研究显示，miR-495 通过靶向血管内皮锌指1（vascular endothelial zinc finger 1，VEZF1）调控内皮或血管生成基因的表达，抑制miR-495 的表达可以解除miR-495 对VEZF1转录功能的抑制，从而提高由iPSCs 诱导分化成ECs 的效率，而且分化生成的ECs 具有较强的血管生成能力，包括细胞增殖、迁移和管状形成等；将iPSCAnti-495-ECs 移植到免疫缺陷MI 小鼠中，能增加梗死心肌组织中新生血管的密度，减小梗死面积。

5 小结

随着干∕祖细胞治疗在MI 后心肌血管再生研究的不断深入，探索干∕祖细胞联合基因修饰在改善干∕祖细胞心肌移植后的微环境、提高移植后干∕祖细胞存活率，以及提高它们的内皮分化效率等方面，将具有广阔的研究和临床应用前景。在干∕祖细胞治疗过程中，如果这些问题能得到解决，MI 后血管再生的研究将会取得突破，从而推动有关临床研究工作的开展。