羧基化多壁碳纳米管对雌性小鼠卵泡发育的影响

郄明丽，李志慧，张伟伟，高言，冯志远，张建海,*

1. 山西农业大学动物科技学院，太谷 030801 2. 生态畜牧与环境兽医学山西省重点实验室，太谷 030801

近年来，伴随着纳米技术的兴起和快速发展，纳米材料被广泛应用，其中纳米碳管(carbon nanotubes, CNTs)是最常见的纳米材料之一，在生物化学、制药和电子应用等领域都拥有广阔的前景[1-3]。同时，由于纳米材料尺寸微小，并可通过口腔或呼吸道进入生物体，其对人和动物的安全性广受关注。有研究显示，表观分子量高达60万的羟基化水溶性CNTs可以在小鼠的不同器官之间自由穿梭，并通过尿液排出体外[4]。然而目前羧基化多壁碳纳米管(MWCNTs-COOH)对于生殖系统尤其是雌性生殖系统的影响尚不明确。

本研究采用水溶性较好的羧基化多壁碳纳米管为研究对象，基于成年雌性小鼠的卵巢病理学，将不同剂量(2.5, 5, 10 mg·kg-1)的羧基化多壁碳纳米管溶液连续给予实验小鼠灌胃64 d，观察卵巢组织形态学变化，评价MWCNTs-COOH对雌性小鼠卵巢形态结构的影响。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 材料

羧基化多壁碳纳米管(MWCNTs-COOH)，购自南京先丰纳米材料科技有限公司。8周龄雌性SD昆明小鼠，体重(31±2) g，购自山西医科大学实验动物中心。

1.2 MWCNTs-COOH的制备与表征

MWCNTs-COOH的纯度>95%，羧基质量分数为1.23%，平均直径为20～30 nm，长度为0.2～2 μm。使用酸洗法除去MWCNTs-COOH表面的铁催化剂。将10 mg MWCNTs-COOH溶入H2SO4/HNO3浓度比为3:1的40 mL混合液中，将其倒入100 mL锥形瓶中，于40～50 ℃水中超声震荡24 h。此后，使用去离子水将悬浮液稀释至400 mL，并用0.22 μm聚酸脂膜过滤膜过滤，重复洗3次。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组及染毒

8周龄雌性SD昆明小鼠40只，适应性饲养一周后随机分成4组，每组10只。给予对照组含0.5% Tween-20的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，试验组分别给予浓度为2.5, 5, 10 mg·kg-1MWCNTs-COOH(溶于0.5% Tween-20的PBS溶液)，连续灌胃64 d。整个试验期间，保证所有小鼠自由饮水，保持鼠房安静、空气流通和温度湿度适中的整体环境，最大限度降低除MWCNTs-COOH外的其他因素的影响。

1.3.2 小鼠生长发育情况观察

MWCNTs-COOH处理期间，每天对实验小鼠的精神状况和饮水采食情况进行观察，每周进行一次称重，并详细记录。

表1 各级卵泡的形态特征Table 1 Morphology of the follicles at different stages

1.3.3 卵巢组织超微结构观察

MWCNTs-COOH处理小鼠64 d后，按100 g体质量0.7 mL腹腔注射20%乌拉坦麻醉，迅速剖开小鼠，以37 ℃生理盐水对小鼠进行心脏灌流。灌流结束后迅速对小鼠右侧卵巢进行前固定、漂洗、后固定、脱水、浸透、包埋、聚合、修整、切片、展片、染色等一系列步骤后，摆放在干净的滤纸上，自然干燥后置于透射电子显微镜下观察，以确定碳纳米管是否进入卵泡。

1.3.4 小鼠卵巢组织病理学观察

小鼠灌流过程同上。取左侧卵巢放入Bouin液中固定，12 h后，放入70%酒精中，换液2～3次，洗去淡黄色苦味酸。此后，依次用80%、85%、90%(2次)、100%(2次)梯度酒精进行组织脱水，再用二甲苯使组织透明，最后进行常规石蜡包埋。继而采用常规HE染色，制作石蜡切片，并应用光学显微镜观察卵巢组织的病理学变化。

雌性哺乳动物出生时卵巢的原始卵泡储备是有限的。在生长和发育过程中，原始卵泡的数目不断减少，只有极少数可以发育到成熟阶段排出体外；反之，停止生长，形成闭锁卵泡。根据卵泡发育过程的形态和功能变化，可分为原始卵泡(primordial follicles)、初级卵泡(primary follicle)、次级卵泡(secondary follicle)和成熟卵泡(mature follicle)4个阶段。不具备生长优势的卵泡在发育进程中形成闭锁卵泡(atretic follicle)。成熟卵泡排除体内后残留的卵泡壁塌陷，卵泡膜的结缔组织、毛细血管等伸入到颗粒层，迅速转变成的富有血管的腺体样结构即黄体(corpus luteum)(表1)。

1.4 数据统计

使用GraphPad Prism5统计软件的one-way analysis of variance (ANOVA)方法进行T检验分析。

2 结果(Results)

2.1 试验小鼠一般情况观察

在整个试验过程中，各组小鼠均未出现非正常

死亡，对照组小鼠活动正常，被毛光亮，饮食正常。此外，试验初期各组小鼠有轻度的烦躁，后期出现食欲降低、精神沉郁、活动减少、饮水减少的情况，且10 mg·kg-1组较为明显，2.5 mg·kg-1和5 mg·kg-1组小鼠无明显临床症状。各剂量组雌鼠体重动态观测结果如图1所示，与对照组相比，小鼠体重在各时间段无显著变化，卵巢的脏体系数也没有显著变化(表2)。

2.2 卵巢的超微结构观察结果

图2为透射电子显微镜下的卵巢组织超微结构代表图，可见5 mg·kg-1组和10 mg·kg-1组卵巢组织中存在羧基化多壁碳纳米管的聚集。

2.3 卵巢组织形态学观察分析

卵巢组织切片经HE染色后用光学显微镜于40倍物镜下观察(图3)，卵巢的皮质含有较多原始卵泡，结缔组织中含有梭形基细胞，走向不规则，无弹性纤维，胶原纤维较少，网状纤维多。髓质中含有较多疏松结缔组织，弹性纤维丰富，其中含有许多大的血管，卵泡较少。

图1 羧基化多壁碳纳米管(MWCNTs-COOH)对雌性小鼠体重的影响(n=10, mean±SD)Fig. 1 Effects of carboxylation functionalized multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs-COOH) on the body weight of female mice (n=10, mean±SD)

表2 不同剂量MWCNTs-COOH暴露下雌性小鼠卵巢脏器系数(g/g,%) (mean±SD)Table 2 The ovarian organ coefficients of female mice exposed to MWCNTs-COOH at different doses (g/g,%) (mean±SD)

图2 5 mg·kg-1和10 mg·kg-1剂量组小鼠卵巢超微结构注：箭头所指为碳纳米管。Fig. 2 Ultrastructure of mice ovary at 5 mg·kg-1 and 10 mg·kg-1 dose groupNote: The arrow indicates the carbon nanotubes.

图3 MWCNTs-COOH对小鼠卵巢组织形态学的影响注：A原始卵泡对比；B初级卵泡对比；C次级卵泡对比；D闭锁卵泡对比。GE，生殖上皮；PF，原始卵泡；PyF，初级卵泡； PO，初级卵母细胞；FC，卵泡细胞；SF，次级卵泡；FA，卵泡腔；CO，卵丘；SG，颗粒层；CR，放射冠；AF，闭锁卵泡。Fig. 3 Effects MWCNTs-COOH on morphological changes of mouse ovaryNote: A, Comparison of primordial follicles; B, Comparison of primary follicle; C, Comparison of secondary follicle; D, Comparison of atretic follicle. GE, germinal epithelium; PF, primordial follicle; PyF, primary follicle; PO, primary oocyte; FC, follicular cell; SF, secondary follicle; FA, follicular antrum; CO, cumulus oophorus; SG, stratum granulosum; CR, corona radiate; AF, atretic follicle.

图4 MWCNTs-COOH对雌性小鼠卵泡数目的影响注：*表示差异显著(P<0.05)；***表示差异极显著(P<0.001)。Fig. 4 Effects of MWCNTs-COOH on the number of follicles in female miceNote: *P<0.05，*** P<0.001， indicates significant difference， respectively.

从HE图片可以看出，对照组小鼠卵巢内原始卵泡(图3A)、初级卵泡(图3B)、次级卵泡(图3C)和闭锁卵泡(图3D)的细胞形态正常，轮廓清晰。与对照组相比，2.5 mg·kg-1组各级卵泡形态结构基本无病理变化；5 mg·kg-1组可见卵巢组织间质内有少量黑色颗粒；10 mg·kg-1组各级卵泡形态结构亦无明显病理变化。

2.4 卵泡数目检测结果

对MWCNTs-COOH暴露下的卵巢组织的卵泡数目在10倍物镜下进行了计数，并应用统计学软件GraphPad Prism5对统计结果进行分析(图4)。分析结果显示，不同剂量的MWCNTs-COOH均降低了小鼠卵巢中的卵泡数目。其中2.5 mg·kg-1组小鼠卵泡数目显著减少(P<0.05)，5 mg·kg-1和10 mg·kg-1组小鼠卵泡数显著减少(P<0.001)。

3 讨论(Discussion)

在之前的纳米毒理学研究中，Mercer等[5]发现CNTs颗粒容易在肺部沉积。而通过吞咽、吸入和气管滴注等方法将小鼠暴露于CNTs后，均可引起小鼠肺脏不同程度的病理变化，严重时其他组织也可见不同程度的氧化应激反应、炎症和纤维化现象，并伴随过敏反应[6-7]。相比之下，经灌胃暴露CNTs的方法则很少用于研究其毒性机制。与此同时，随着碳纳米管在生物毒性方面研究的深入，除对肺脏、肝脏等靶器官的研究外，对于其生殖毒性的研究也逐渐引起人们的重视。在对CNTs生殖毒性的研究中发现，雄性小鼠经口暴露于MWCNTs后，可观察到血清中游离睾酮水平的剂量依赖性降低及精子受精能力的显著降低[8]。此外，腹腔注射MWCNTs后，青春期Wistar大鼠呈现出剂量依赖性的显著的睾丸和附睾功能障碍[9]。并且在最近的研究中，给予雄性Wistar大鼠2和10 mg·kg-1功能化的MWCNTs(functionalized-MWCNTs, f-MWCNTs)，持续15次交替的腹膜内剂量，观察到精子的显著损害，生殖上皮的变性和生殖细胞的丧失[10]。然而，对于CNTs雌性生殖毒性的研究则相对较少。因此，本实验拟采用灌胃处理的方法，按照2.5, 5, 10 mg·kg-1剂量标准，对8周龄雌性SD昆明小鼠进行持续64 d的MWCNTs-COOH暴露，以探究MWCNTs-COOH的雌性生殖毒性机制。

卵巢是产生卵子及分泌激素的器官，是雌性生殖系统的重要组成部分。卵巢的健康状况可以通过卵巢标本中各级卵泡和黄体的病理学观察以及计数该卵巢标本中原始、初级、次级卵泡以及闭锁卵泡和黄体数目的算数平均值来反映。有研究表明，ICR小鼠暴露于磷酸胆碱多壁碳纳米管环境中，在10 mg·kg-1剂量下，没有发现任何全身毒性和组织病理学的变化[11]。暴露途径下小鼠的卵巢组织结构正常，各级卵泡以及成熟卵泡和黄体均未见明显的缺失或结构的异常[12]，表明碳纳米管对于小鼠具有良好的雌性生殖相容性。此外，有研究证明低剂量的2,2-溴乙基丙二醇降低了原始卵泡和生长卵泡的数目，但是并未影响小鼠的生殖力[13]。也有研究显示，多次暴露MWCNTs-COOH并未造成明显的病理学改变，各级卵泡和黄体数目、子宫内膜和肌层厚度均无显著性变化[14]。相似地，不同剂量的MWCNTs-COOH同样未对卵巢的形态结构产生明显影响。同时，在对卵巢中各级卵泡的总数进行统计时发现，随着MWCNTs-COOH剂量的加大，卵巢中卵泡总数显著减少。

基于目前的实验结果，在经口腔暴露MWCNTs-COOH的情况下，卵巢卵泡的形态结构并未受到明显影响，提示MWCNTs-COOH可能具有良好的雌性生殖安全。但是，MWCNTs-COOH在动物生殖发育的其他阶段的安全问题，仍需要进一步研究。