牛肉玻璃化冻藏温度对肉品质的影响

董欢，杨菊梅，王松磊,何智武,KAZUHIRO NAKANO, 王莉，马莹,贺晓光*

1(宁夏大学 农学院，宁夏 银川，750021)2(宁夏尚农生物科技产业发展有限公司，宁夏 固原，756000) 3(Graduate School of Science and Technology, Niigata University, Niigata, 950-2181)

牛肉销量大，蛋白质、矿物质含量高，脂肪、胆固醇低，含有人类生命活动中必需氨基酸，是一种营养价值高的保健型肉类食品[1-2]。随着人们生活水平的提高，对肉制品品质提出了更高要求[3]。贮藏方式对牛肉品质有很大影响。目前关于牛肉贮藏，袁先群等[4]采用0～4 ℃、7～11 ℃两个贮藏温度研究黑牛肉品质变化规律；李静等[5]研究不同真空冷却方式对酱牛肉品质的影响；冯宪超等[6]研究了快速冷冻工艺对牛肉品质和组织的结构的影响。由此可知低温贮藏是最为实用的一种方法，在此过程中，与分子流动性相关的质量特性如微生物、质构、营养物质、化学反应及货架期等在很大程度上与玻璃化转变温度有关。玻璃化转变是指非晶态聚合物(包括晶态聚合物的非晶态部分)从玻璃态到橡胶态或橡胶态到玻璃态的转变，其特征温度称为玻璃化转变温度[7]。根据玻璃化转变温度理论，相关学者认为，食品玻璃化保藏可最大限度的保证其色、香、味、营养物质稳定。食品贮藏温度T≤Tg时，体系处于玻璃态，分子流动性降低、黏度较高，此时稳定性最强。T≥Tg时，分子流动性增大，容易发生脂肪酸败、蛋白变性和酶促褐变等化学变化[8-10]。周国燕等[11]采用连续扫描法和分步扫描法对浓缩草莓汁进行了玻璃化转变温度进行了测量。蔡长河等[12]采用差示扫描量热法对经冷冻干燥的处理后的半干型荔枝干进行了玻璃化转变温度的测量。石启龙等[13]采用了差示扫描量热法测定了真空干燥雪莲果粉的玻璃化转变温度。段人钰等[14]利用差示扫面量热法对包子馅(鸡肉)的玻璃化转化温度进行了测量并预测了货架期。目前，大多数关于牛肉冷冻贮藏品质的研究局限于单一成分、理论上的研究，并且牛肉水分含量大，成分复杂，Tg的测定比较困难，玻璃态贮藏研究较少。

本实验以牛肉为研究对象，基于玻璃化转变理论，采用Q-20型差示扫描量热仪(DSC)测定玻璃态转变温度(Tg)，结合冷冻贮藏过程中的微生物、理化指标等综合研究牛肉的冷冻贮藏品质变化，为今后牛肉玻璃化转变研究提供理论依据[15]。实验在Tg左右贮藏7个月，每隔1个月测定微生物、嫩度、挥发性盐基氮、颜色参数，分析各指标变化规律，探讨不同温度和时间对牛肉品质的影响，以寻求牛肉最佳贮藏条件。

1 材料与设备

1.1 实验材料

新鲜牛后腿肉,宁夏吴忠市涝河桥清真肉食品有限公司；平板计数琼脂培养基(分析纯)，山东浩中化工科技有限公司；0.9%无菌生理盐水(分析纯)，北京惠保联化科技有限公司；氧化镁混悬液、硼酸吸收液(分析纯)，济宁宏明化学试剂有限公司；0.01 mol/L盐酸标准滴定溶液(分析纯)，石家庄鑫隆威化工有限公司；甲基红-乙醇指示剂、次甲基蓝指示剂(分析纯)，厦门海标科技有限公司。

1.2 主要设备

Q-20型差示扫描量热仪(DSC)，美国TA公司；DC-P3色差计，北京市兴光测色仪器公司；pHS-3c pH计，北京市兴光测色仪器公司；TA-XT plus质构仪(刀具HDP-BSW)，英国Stable Micro Systems有限公司；热电耦测温仪，上海飞龙仪表电器有限公司；KDY-9820凯式定氮仪，北京通润源机电技术有限责任公司；JA3102分析天平，上海海康电子仪器厂；LDZX-40C灭菌锅，上海三申医疗器械有限公司；生化恒温培养箱，上海-恒科技有限公司；超净工作台，苏净集团安泰公司；BD/BC-268H冰箱，广东容声电器股份有限公司；BCD-649WE冰箱，青岛海尔股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

采购的新鲜牛后腿肉立即进行分割处理，分割工具及相关用具经过煮烫、酒精消毒等处理，使操作间最大程度减少染菌存在。剔除样品中可见脂肪，根据各指标所需肉样切割，分装于食品级自封袋中。当天对受温度和时间影响较大的颜色参数、嫩度、微生物和玻璃态转变温度进行测量，隔天进行挥发性盐基氮的测量，后期每隔1个月对各指标进行检测。

1.3.2 玻璃态转变温度Tg的测定

Tg测定前，须对仪器进行温度和灵敏度校准。称取10～20 mg肉样使用压片机密封于坩埚内，放于DSC样品池中，参比端放置空坩埚作对照。利用液氮对肉样冻结，保护气体为高纯氮气，气流量50 mL/min。采用仪器自带TA软件分析试样的热流密度曲线得到初始(Tgi)、中点(Tgm)和终点(Tge)值，取中点Tgm作为最终玻璃化转变温度。

经预实验确定扫描程序为：初始温度为室温，以20 ℃/min冷却至-60 ℃，恒温10 min后以10 ℃/min升温至-20 ℃，退火30 min后以10 ℃/min降至-60 ℃，恒温10 min后以10 ℃/min升至20 ℃。退火30 min是由于牛肉成分复杂，水分含量大，玻璃态转变台阶不容易出现，退火温度也就是冻结终点T’m，其值为冰晶熔融吸热峰右边基线与左边基线的交点所对应的温度。

1.3.3 颜色参数的测定

肉样切成40 mm×40 mm×10 mm方块，测量之前将各温度梯度肉样于4 ℃解冻(12±2) h取出，待中心温度达室温后使用色差仪进行测量，测量前须白板校正，镜口紧贴肉面，测量并记录L*、a*、b*数据，每个样品重复3次取均值。

1.3.4 嫩度的测定

参照农业部行业标准—NY/T 1180—2006《肉嫩度的测定剪切力测定法》[16]，冷却后的肉样沿着与肌纤维平行方向切成20 mm×10 mm×10 mm肉条，不能夹带结缔组织。

1.3.5 菌落总数的测定

参照GB 47892—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》法[17]，在无菌坏境下进行操作实验。结果以lgCFU/g(colony-forming units，CFU)表示。根据我国食品卫生标准规定，食品中细菌总数小于4.7 lgCFU/g时，为一级鲜肉，在4.7～6.7 ogCFU/g间为二级鲜肉，大于6.7 lgCFU/g时即为腐败肉。

1.3.6 TVB-N的测定

使用GB/T5009.44—2003《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》方法[18]：半微量定氮法测量TVB-N的含量，每个样本重复3次，同时做试剂空白实验。根据GB2707—2005《鲜(冻)畜肉卫生标准》[19]的规定评判肉品新鲜度。一级鲜度肉品其TVB-N值≤15 mg/100 g；二级鲜度为15～25 mg/100 g；变质肉>25 mg/100 g。

1.3.7 数据处理

采用Origin 8.5软件、Excel 2003对实验数据进行处理，应用SPSS 17.0软件中的ANOVA单因素方差分析和邓肯多重比较进行差异性分析。

1.4 品质变化动力学模型的建立

TVB-N品质变化遵循一级化学反应动力学模型[20]。

A=A0exp(kt)

(1)

式中：t为贮藏时间，d；A0为食品的初始品质；A为食品贮藏t天时的品质；k为食品品质变化速率常数。

根据不同贮藏温度和时间下的TVB-N值，求得反应速率常数k，通过k与T的Arrhenius方程，通过变型计算活化能Ea和指前因子k0。

k=k0exp(-Ea/RT)

(2)

式中：k0为指前因子；Ea为活化能(kJ/mol)； R为气体常数8. 314 kJ/mol；T为绝对温度(K)[21]。

2 结果与分析

2.1 牛肉玻璃化转变温度Tg的测定

根据DSC曲线，取中点Tgm作为最终Tg值，Tg=-14 ℃，这与AHMET AKKSE的研究结果较为接近，其Tg= -13 ℃。因为牛肉产地不同造成蛋白、脂肪和水分比例不一样。其次，测定条件也是造成此差异的原因。目前，测定牛肉Tg的研究不充分。1989年LEVINE[22]报道牛肉Tg值>-5 ℃，BRAKE等[23]于1999年测定出牛肉Tg值为-12 ℃。李云飞等[24]于2003年测定了牛肉糜和牛肉肌动蛋白的部分玻璃化转变温度，得到平均转变温度约为-52.54 ℃。不同学者对牛肉Tg值的测定结果差异很大，其原因目前还未有一个科学解释，有待进一步研究探讨。本实验中牛肉玻璃化转变台阶不是很明显，但通过仪器自带分析软件可以测量。图1是本实验DSC曲线图。

图1 牛肉的DSC曲线Fig.1 Typical DSC thermogram for beef

2.2 不同贮藏温度和时间对牛肉菌落总数的影响

牛肉的腐败变质与微生物数量有很大关系，因此，菌落总数可作为评价牛肉腐败程度的一项重要指标。由图2可知，随贮藏时间的延长，菌落总数整体呈上升趋势。在整个贮藏期间，每种贮藏温度下牛肉的lgCFU/g都未达到6.7，说明在这几种温度下贮藏牛肉7个月，都未腐败变质。-10 ℃与其余3种温度贮藏的牛肉其菌落总数对数值在前5个月差异显著(p<0.05)，-14 ℃在前5个月内菌落总数对数值与-18 ℃、-22 ℃无显著差异。从微生物增长曲线可以看出，Tg或低于Tg贮藏牛肉，短期内其稳定性好，微生物数量有所下降，是因为-14、-18、-22 ℃贮藏牛肉不利于一些嗜热菌生长。

图2 不同贮藏温度和时间下牛肉菌落总数的对数值Fig.2 lg(CFU/g) value of beef at different frozen temperature and period

2.3 不同贮藏温度和时间对牛肉颜色参数的影响

2.3.1 不同贮藏温度和时间对牛肉L*值的影响

由图3可知，随着贮藏时间的延长，-10 ℃条件下贮藏牛肉L*值在第1个月减小，与初始值23.12相比差异显著(p<0.05)，随后先增大再减小，贮藏6、7个月L*值与新鲜肉相比差异极显著(p<0.01)。在-14、-18、-22 ℃条件下贮藏牛肉，其L*值均先增大后减小，最终接近初始值。

初期-10 ℃贮藏牛肉，肉表面水分损失严重导致光反射率降低，L*值显著下降，后期微生物数量急剧增加，开始大量分解蛋白质，牛肉细胞和组织严重受损，解冻后，大量水分溢出肉面，导致L*值升高。在整个贮藏期间，Tg或低于Tg贮藏牛肉，L*值相差不大。-14、-18、-22 ℃贮藏牛肉其L*值持续增加至第四个月，开始减小，是因为贮藏初期温度低，对细胞和组织有破坏，L*值上升，但上升幅度不大，后来随着冰晶的和微生物数量不断增大，L*值持续增长，后期开始下降。综合考虑，微生物、冻结和解冻是影响L*值变化的原因。MUELA等[25]研究冻藏对羊肉色度的影响与本研究结果相似。

图3 不同贮藏温度和时间下牛肉L*值Fig.3 L* value of beef at different frozen temperature and period

2.3.2 不同贮藏温度和时间对牛肉a*值的影响

由图4可知，-10 ℃时a*值随时间的延长明显降低，差异极显著(p<0.01)。-14、-18、-22 ℃条件下贮藏，a*值在第1个月增大，与初始值10.94相比差异性显著(p<0.05)，随后降低，在第5个月，4种贮藏温度下的a*值与初始值相比差异性均为极显著(p<0.01)。-10 ℃贮藏牛肉其a*值与其余3种温度的a*值相比差异极显著(p<0.01)。

肉品贮藏过程中高铁肌红蛋白的积累是导致肉品发生褐变的主要原因[26]。-10 ℃时，随着贮藏时间的延长，水分损失严重，微生物数量持续增大，pH值升高，脂肪氧化程度加剧，促进了高铁肌红蛋白的积累，使得a*值持续降低。在Tg或低于Tg下贮藏，a*值在第1个月增大，原因是由于冻结对肌肉细胞和组织造成损伤，肌肉表面水分较多，减小了蛋白和氧气接触的概率；随着贮藏时间的延长，水分升华，氧合肌红蛋白进一步氧化为高铁肌红蛋白，这是a*值减小的原因。VIEIRA等[27]在牛肉的冻藏实验中指出，a*值随贮藏时间的延长而减小，与本实验结果吻合。

图4 不同贮藏温度和时间下牛肉a*值Fig.4 a* value of beef at different frozen temperature and period

2.3.3 不同贮藏温度和时间对牛肉b*值的影响

由图5可知，b*值随贮藏时间的延长增大，说明肉品贮藏过程中发生了脂肪氧化[28]。从第2个月开始，b*值与初始值3.32相比差异性显著(p<0.05)。随贮藏温度的上升，贮藏3～5个月，-10 ℃与其余3种温度贮藏的b*值间差异性显著(p<0.05)；6～7个月，-10℃与-14 ℃贮藏的b*值间无显著性差异(p>0.05)，与-18 ℃、-22 ℃贮藏的b*值间差异性显著(p<0.05)。

-10 ℃下贮藏牛肉其b*值随贮藏时间的延长增长速度明显大于其余3种温度，说明脂肪氧化速度快，肉品贮藏稳定性差。原因是贮藏温度高于Tg体系处于橡胶态或黏流态，物质的自由体积增大，黏度下降，脂质氧化、蛋白质变性、酶促褐变等受扩散控制的各种反应速率增大，物质劣变速度和程度加大。但在第5个月，-14 ℃贮藏的b*值明显增大，与-18 ℃、-22 ℃贮藏的b*值差异显著，说明牛肉在Tg贮藏，前期稳定性好于后期。

图5 不同贮藏温度和时间下牛肉b*值Fig.5 b* value of beef at different frozen temperature and period

2.4 不同贮藏温度和时间对牛肉嫩度的影响

本实验中牛肉的嫩度采用剪切力值表示。由图6可知，整个贮藏期间，所有温度下牛肉的剪切力均先增大后减小，这与BENJAKL及HALE and WATERS研究结果吻合[29-30]。4个温度下的牛肉剪切力值在前3个月内均随贮藏时间的延长明显增加，与初始值6.52 kg相比差异极显著(p<0.01)。原因是肌肉组织间形成的冰晶不断增大，使肌纤维逐渐收缩导致牛肉剪切力增大，嫩度下降。贮藏后期，-10 ℃、-14 ℃下牛肉的剪切力值急剧下降，最终接近初始值，差异不显著。原因是随贮藏时间的延长，冰晶不断增大导致肌纤维断裂，肌肉组织结构受到严重损坏。整个贮藏期间，-18 ℃、-22 ℃贮藏的剪切力值间差异不显著(p>0.05)，且温度越低，肉品剪切力值变化程度越小。由此可以得出，当以嫩度为指标评价牛肉贮藏品质时，Tg以下贮藏牛肉其嫩度稳定性最好。

图6 不同贮藏温度和时间下牛肉剪切力值Fig.6 the cutting force of beef at different frozen temperature and period

2.5 不同贮藏温度和时间对牛肉TVB-N的影响

TVB-N是衡量肉品新鲜度和腐败程度的重要指标。由图7可知，各温度下牛肉的TVB-N值随贮藏时间的延长逐渐增加。在-10 ℃贮藏1个月后其TNB-N值与新鲜肉相比差异极显著(p<0.01)；在Tg或低于Tg贮藏，TVB-N值在第2个月开始明显增加，差异极显著(p<0.01)。-10 ℃与-14、-18、-22 ℃的TVB-N值在前5个月内差异性显著(p<0.05)，5个月以后，-14 ℃贮藏牛肉其TVB-N随贮藏时间的延长增加幅度上升，与-18 ℃、-22 ℃的TVB-N值相比差异显著(p<0.05)，与-10 ℃的TVB-N值相比差异不显著(p>0.05)。牛肉在-10 ℃贮藏4个月，从一级鲜度肉变为二级鲜度；在-14、-18、-22 ℃贮藏6个月变为二级鲜度。由此可以得出在Tg或低于Tg贮藏牛肉其稳定性均较好，也能有效抑制蛋白质变性，脂肪酸败，减缓新鲜肉腐败速率，延长货架期。

图7 不同贮藏温度和时间下牛肉TVB-N值Fig.7 TVB-N value of beef at different frozen temperature and period

2.6 品质变化动力学模型的分析

根据方程(1)变型得到lnA=kt+lnA0，以TVB-N的对数值为纵坐标，贮藏时间t为横坐标，得到图8，斜率为反应速率常数。R2大则说明数据间线性关系好。从图中可以看到，反应速率常数随贮藏温度的降低而减小。

-10、-14、-18、-22 ℃温度下的斜率分别为0.005 3、0.005 1、0.004 7、0.004 7，斜率间差别很小，说明低温下贮藏牛肉对反应速率常数影响不大。将方程(2)转化成对数模型即为lnk=(-Ea/RT)+lnk0，以lnk对1/T作图，斜率为-Ea/R，截距为lnk0，得到如图9的结果，Ea值为0.2 kJ/mol，指前因子k0为0.004 2，建立牛肉贮藏期间TVB-N品质变化的Arrhenius方程：k=0.004 2exp(-0.2/RT)。利用此模型根据方程(1)，当确定贮藏温度时，根据各指标的初始值和终点值即可推算出牛肉理论上的贮藏时间。

国家规定，冻猪肉冷藏安全期为7～10个月，冻牛羊肉为8～10个月，冻禽肉为6～8个月。本实验进行了贮藏期为7个月的实验，因此可根据贮藏第7个月时TVB-N的终点值对理论贮藏值和实测值进行对比研究。

图8 不同贮藏温度下TVB-N随时间变化的线性规律Fig.8 the color changing with time under different storage temperature linear rule

图9 TVB-N的阿伦尼乌斯曲线Fig.9 Arrhenius curve of TVB-N change

贮藏温度/℃终点值理论货架期/d实测货架期/d相对误差/%-1019．89250．021019．05-1419．57247．621017．90-1816．77209．52100．24-2216．65209．52100．24

由表1可知：-10 ℃、-14 ℃贮藏条件下，牛肉的实测货架期均小于理论货架期，而-18 ℃、-22 ℃贮藏牛肉其实测货架期和理论货架期差异小，相对误差仅为0.24%。说明玻璃化温度以下贮藏牛肉肉品稳定性更好。在牛肉的玻璃化转变温度点-14 ℃贮藏牛肉，后期肉品质稳定性差。

3 结论

通过DSC测量出生鲜牛肉玻璃化转变温度Tg值为-14 ℃，在等于和低于此温度下对牛肉进行冷冻贮藏其各项检测指标及稳定性较好。L*值在整个贮藏期间变化不大，较稳定，a*值在贮藏初期增大，后期减小；b*值随贮藏时间的延长而逐渐增大；整个贮藏期间，随着时间的延长，各个温度下剪切力均先增大后减小，说明嫩度先增大后减小；菌落总数整体呈上升趋势，TVB-N值也逐渐增加，但均未腐败变质。对牛肉品质(TVB-N)变化的动力学模型分析：各温度下牛肉的理论贮藏天数分别为250、248、210、210 d，与实测值210 d相比，-18 ℃、-22 ℃温度下贮藏牛肉肉品稳定性更好。综合上述各项实验检测结论可知，牛肉如果贮藏期在5个月以内，建议贮藏温度为-14 ℃，大于5个月，从牛肉品质和生产成本角度建议贮藏温度为-18 ℃较为理想。同时也证明，食品的贮藏温度T≤Tg时，体系处于玻璃态，此时稳定性最强，在Tg贮藏牛肉，贮藏前期稳定性较好。在-18 ℃与-22 ℃温度下贮藏牛肉，品质差别不大。

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