黄酮“落新妇苷”对胰脂肪酶抑制作用研究

郑丹，张清峰

(江西农业大学 食品科学与工程学院，江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西 南昌，330045)

以甘油三酯为主的食物脂肪摄入后，须通过胰和胃脂肪酶水解成单酰甘油和游离的脂肪酸后才能被吸收。脂肪酶抑制剂通过抑制胰和胃脂肪酶活性，可以减少膳食中脂肪的吸收，并通过粪便直接排泄，从而达到控制和治疗肥胖的目的。脂肪酶抑制剂因不影响食欲和人体神经系统，已被证实有较高安全性。因此，从天然植物中寻找安全有效的脂肪酶抑制剂成为预防和治疗的肥胖热点问题[1-2]。研究表明许多黄酮单体或富含黄酮的植物提取物有脂肪酶抑制活性[2-4]。

落新妇苷是一种广泛存在于植物及其加工食品中的功能性黄酮成分，如土茯苓[5]、龟苓膏[6]、葡萄(葡萄酒)[7]、罗汉茶[8]等。我们前期研究发现给高脂小鼠喂食土茯苓总黄酮及落新妇苷单体可显著减少小鼠体重增幅、腹腔脂肪重量、血清中甘油三酯含量[9]。本文通过研究落新妇苷对胰脂肪酶的抑制活性，进一步解释其可能的作用原因。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

落新妇苷由本实验室从土茯苓中纯化，经 UV、IR、MS 和 NMR 鉴定，纯度>98%；猪胰脂肪酶，上海晶纯生化科技股份有限公司；4-硝基苯棕榈酸酯(PNPP)，上海晶纯生化科技股份有限公司；4-硝基苯酚(PNP)，上海展云化工有限公司；阿拉伯树胶，上海青析化工科技有限公司；脱氧胆酸钠，上海晶纯生化科技股份有限公司；Tris-HCl，北京索莱宝科技有限公司。其他所用试剂均为分析纯。

1.2 试验主要仪器

HH-6数显恒温搅拌循环水箱，常州国华电器有限公司；5600型可见分光光度计, 江苏晶禾科仪厂；970CRT型荧光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 主要试剂的配制

配制50 mmol/L pH 8.0的Tris缓冲液，并加入0.1%阿拉伯树胶粉和0.2% 脱氧胆酸钠。用Tris缓冲液配制1.2 mg/mL的胰脂肪酶溶液，混匀后5 000 r/min离心取上清液。精确称取22.5 mg落新妇苷用60%乙醇溶解至5 mL，再取1 mL用Tris缓冲液稀释至10 mL得到1 mmol/L的落新妇苷溶液。底物PNPP先溶于无水乙醇，再用Tris-HCl缓冲液稀释，最终浓度为0.2 mmol/L，乙醇体积分数为1%。

1.3.2 PNP标准曲线的绘制

精密称取PNP，用乙醇配成浓度为5 mmol/L的母液，后用Tris缓冲液分别稀释至0.01、0.025、0.04、0.05、0.075 mmol/L, 测定其在405 nm处的吸光度。以PNP浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程为Y=16.908X+0.017 5，线性相关系数R2=0.997 4。

1.3.3 最适胰脂肪酶反应体系建立

将胰脂肪酶溶液，底物溶液以及缓冲液在37 ℃水浴中保温10 min，分别取0.5 mL Tris缓冲液(pH 8.0)和胰脂肪酶溶液，再加入1 mL底物PNPP溶液，混匀后反应不同时间(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 min)，然后在405 nm波长下测定吸光度。以0 min时混合液的吸光度为空白，每组做3个平行，找出最适反应时间。在最适反应时间下，改变缓冲液pH(6.0、7.0、8.0)和水浴温度(25、37 ℃)，找出最适反应温度和pH。

1.3.4 落新妇苷与胰脂肪酶作用时间对其抑制作用的影响

在37 ℃水浴中保温10 min后，分别移取0.3 mL Tris缓冲液、0.2 mL落新妇苷溶液、0.5 mL胰脂肪酶溶液于试管中，混匀后在37 ℃水浴中分别静置0、2、4、6、8、10 min后，再加入1 mL PNPP底物溶液，37 ℃水浴反应20 min后测定405 nm处吸光度A1；将落新妇苷溶液换为缓冲液得到吸光度A2；以加入PNPP后反应0 min时吸光度为A0(空白)。实验重复3次，取平均值，计算抑制率，如公式(1)所示：

(1)

1.3.5 落新妇苷浓度对胰脂肪酶抑制作用的影响

在37 ℃水浴中保温10 min后，分别移取0.3 mL 缓冲液、0.2 mL不同浓度落新妇苷溶液(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mmol/L)、0.5 mL胰脂肪酶溶液于试管中，混匀后在37 ℃水浴中静置10 min，再加入1 mL PNPP底物溶液，在37 ℃水浴中反应20 min后，在405 nm波长下测定其吸光度。按1.3.4计算抑制率，实验重复3次，取平均值。

1.3.6 落新妇苷抑制胰脂肪酶的动力学特征

在37 ℃水浴中保温10 min后，分别吸取0.3 mLTris缓冲液、0.2 mL落新妇苷溶液、0.5 mL胰脂肪酶溶液，再加入1 mL不同浓度的底物PNPP溶液(0.05～0.5 mmol/L)，37 ℃水浴反应20 min后，测定405 nm吸光度，扣除空白后根据PNP标准曲线，计算PNP生成量，再除以反应时间20 min，得到酶促反应速度，按照Lineweaver-Burk 的双倒数作图法，确定抑制作用的类型。

1.3.7 荧光光谱滴定法测定落新妇苷与胰脂肪酶的相互作用

将落新妇苷(0.01 mol/L)用Tris缓冲液稀释100倍后，分别取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL于5 mL比色管中，再各加入1 mL胰脂肪酶溶液，最后用Tris缓冲液定容至5 mL。摇匀后测定荧光强度，设定激发波长为280 nm，发射波长扫描范围为280～450 nm，灵敏度为2，激发和发射的狭缝宽度均为10 nm。

1.3.8 数据统计

实验平行重复3次，取平均值，使用origin 8.0 (Origin Lab Co., Northampton,MA, USA)软件进行数据统计分析、绘图和曲线拟合。

2 结果与讨论

2.1 最适胰脂肪酶反应体系建立

胰脂肪酶可以将底物PNPP水解，产物为PNP和棕榈酸，PNP在405 nm处有最大吸收，因此可以通过测定405 nm处的吸光度反映酶活力。酶促反应速度需要在底物充足的情况下测定，因为在一个封闭的反应体系中，随着反应时间的增加，底物逐渐被消耗，底物不足会使酶促反应速度逐渐下降。由图1可知，在0～20 min内吸光度随时间的延长线性增大，说明在此时间段底物是充足的，酶促反应速度恒定；20 min之后，吸光度的增长速率逐渐减慢，说明底物不充足，酶促反应速度下降。因此选择反应时间为20 min。

图1 最适胰脂肪酶反应时间确定Fig.1 The optimal reaction time of pancreatic lipase

改变反应体系的pH值为6.0、7.0和8.0，实验结果表明pH值为7.0时反应速度很慢，在pH 6.0时几乎不反应。当反应温度设置为25 ℃时，反应速度变得很慢。因此，本实验的最佳反应体系确定为pH 8.0、37 ℃下反应20 min。

2.2 落新妇苷与胰脂肪酶作用时间对抑制作用的影响

恒定落新妇苷的浓度为100 μmol/L，图2为落新妇苷与胰脂肪酶作用不同时间对其抑制作用的影响。结果表明，随着落新妇苷与胰脂肪酶作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，说明二者的结合需要一定的时间。王诗卉等在研究儿茶素(EGCG)对胰脂肪酶抑制作用时也发现，EGCG与胰脂肪酶刚混合时，抑制作用很差；抑制率随两者作用时间的延长逐渐增强[10]。根据图2，确定落新妇苷与胰脂肪酶作用时间为10 min。

图2 不同作用时间对胰脂肪酶抑制作用的影响Fig.2 The effects of interaction time between astilbin and pancreatic lipase on the inhibition rate

2.3 落新妇苷浓度对胰脂肪酶抑制作用的影响

图3为不同浓度的落新妇苷对胰脂肪酶的抑制效果。在0～20 μmol/L浓度范围内，随着落新妇苷浓度的增加抑制率快速增加；此后继续增加落新妇苷浓度，抑制率趋于稳定。浓度为120 μmol/L时，落新妇苷对胰脂肪酶的抑制率为56.3%。根据曲线，落新妇苷对胰脂肪酶的半抑制率浓度大约为105 μmol/L。张晨辰等[11]研究发现，100 μmol/L条件下，槲皮素对胰脂肪酶活性的抑制率为65.5%；其他许多黄酮化合物如高良姜精，黄芩素，芸香叶苷等都可有效抑制胰脂肪酶活性，提示黄酮类化合物有可能成为新型的胰脂酶抑制剂。

图3 落新妇苷浓度对胰脂肪酶抑制作用的影响Fig.3 The effects of astilbin concentration on the inhibition of pancrelipase

2.4 落新妇苷抑制胰脂肪酶的酶动力学特征

根据酶与抑制剂相互作用方式，可逆抑制作用有竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制等3种形式。竞争性抑制是抑制剂与底物竞争与酶活性中心结合从而使酶活性降低, 酶动力学表现为米氏常数(Km)增大，而最大反应速度(vmax)不变。非竞争性抑制指抑制剂与酶活性中心以外的其他部位结合，从而使酶的催化活性降低，酶动力学表现为vmax变小，但Km不变。改变底物PNPP的浓度[S]，测定得到有无落新妇苷条件下对应的酶促反应速度v，根据Lineweaver-Burk双倒数方程，以1/[S]对应1/v作图，得到图4。落新妇苷不改变胰脂肪酶与底物的亲和程度, 即Km值不变，但vmax减小，说明落新妇苷是胰脂肪酶非竞争性抑制剂。落新妇苷与胰脂肪酶活性中心以外的其他部位结合，这种结合不影响酶活性中心与底物的结合，因此Km值不变，但酶-底物-抑制剂三者复合物不能分解为产物PNP，因此vmax减小。

图4 落新妇苷抑制胰脂肪酶的Lineweaver-Burk双倒数方程拟合曲线Fig.4 Fitting curve of Lineweaver-Burk double reciprocal equation of astilbin inhibition of pancreatic lipase

2.5 荧光光谱法分析落新妇苷对胰脂肪酶结合作用

胰脂肪酶中含有色氨酸残基，可以发射荧光。图5为脂肪酶的荧光发射光谱，脂肪酶的最大激发波长为280 nm，最大发射波长为341 nm。加入落新妇苷会使胰脂肪酶的内源荧光强度有规律的降低，即发生荧光淬灭现象，并使其最大发射波长向长波方向移动至356 nm，说明二者有相互结合作用。可通过公式(2)来计算落新妇苷与落新妇苷之间的结合常数Ka和结合位点数n[13]。

(2)

图5 落新妇苷对胰脂肪酶荧光光谱的影响Fig.5 The effect of astilbin on fluorescence emission spectra of pancreatic lipase注：1～9中落新妇苷质量浓度分别为0,2,4,6,8,10,12,14,16,18 μmol/L

图和lgcq线性回归曲线Fig.6 The linear graphs of lg and lgcq

3 结论

黄酮“落新妇苷”对胰脂肪酶有一定的抑制作用，半抑制率浓度为105 μmol/L，最大抑制率为56.3%；且抑制效果随二者作用时间延长而增强。落新妇苷不改变胰脂肪酶与底物的亲和程度，但使其最大反应速度减小，是胰脂肪酶的非竞争性抑制剂。荧光光谱滴定实验表明落新妇苷可与胰脂肪酶结合，二者结合常数lgKa为5.50，结合位点数n为1.17。本研究结果表明落新妇苷可以抑制胰脂肪酶活性，这可能是其有脂肪代谢调节作用的机制之一。

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