小麦酒精糟饲用发酵菌种筛选及其发酵条件优化

李姗，郭文杰，李吕木*，鲁陈，卫爱莲

1(安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥，230036)2(安徽瑞福祥食品有限公司，安徽 亳州，236800)

小麦酒精糟是小麦在生产酒精过程中产生的主要副产物，干物质中粗蛋白含量约占39%[1]，且含有丰富的氨基酸、维生素和多种微量元素等[2-3]，可直接饲喂动物[4]，但其含水量高达70%～85%，运输成本高且易腐败变质[5]。因此，通常是烘干生产小麦干酒精糟[6]，但烘干的成本较高[7]，并且高温烘干会造成蛋白质变性[8]，导致饲用品质下降[9-10]。为克服烘干的不足，有学者对玉米酒精糟进行发酵，生产水分含量在30%左右的发酵玉米酒精糟，其真蛋白由21.54%提高到30.22%，3种重要氨基酸(蛋氨酸、赖氨酸、苏氨酸)总含量提高了28.41%，从而使饲养价值得到提高[11]。大量文献表明蛋白质饲料通过微生物发酵可提高其小肽含量[12]，增强其抗氧化活性，可改善动物的免疫功能[13-14]。但对小麦酒精糟的发酵饲用尚未见报道，为此，本研究通过混菌固态厌氧发酵小麦发酵酒精糟，以酸溶蛋白为主要考察指标，兼顾有利于提高动物适口性的pH指标和考察经济性的发酵损耗指标，进行发酵菌种筛选，发酵条件优化，以期获得低水分的饲用发酵小麦酒精糟。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦酒精糟：水分74.86%，粗蛋白9.58%；次粉：水分9.69%，粗蛋白14.45%，均由安徽瑞福祥食品有限公司提供。

菌种：乳酸菌(Laobacillus)-1(M1)、乳酸菌-2(M2)、乳酸菌-3(M3)、乳酸菌-4(M4)、乳酸菌-5(R-02)、芽孢杆菌(B.subtilis)-1(N1)、芽孢杆菌-2(N2)、芽孢杆菌-3(N3)、芽孢杆菌-4(N4)、芽孢杆菌-5(KG109)、酵母菌(Saccharomyces)-1(P1)、酵母菌-2(P2)、酵母菌-3(P3)、酵母菌-4(P4)、酵母菌-5(P5)均为本实验室保藏的饲用菌种。

牛肉膏蛋白胨培养基，MRS培养基，PDA培养基，C2HCl3O2、浓H2SO4、CuSO4：分析纯，西陇科学股份有限公司；NAOH：分析纯，烟台市双双化工有限公司；K2SO4：分析纯，无锡市展望化工试剂有限公司；浓HCl：分析纯，上海振企化学试剂有限公司等。

1.2 仪器与设备

DGT-G135C型精密鼓风恒温干燥箱，合肥达斯卡特科学器材有限公司；BSB224S型电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；SKD-200型凯氏定氮仪，上海沛欧分析仪器有限公司；SKD-20N型智能数控消化炉，上海沛欧分析仪器有限公司；YXQ·SG41·280型手提式压力蒸汽灭菌器，上海华线医用核子仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pH值的测定

采用PHS-25型pH计按国标测定[15]。

1.3.2 发酵饲料水分的测定

采用恒重法测定样品中的水分含量[16]。

1.3.3 粗蛋白质的测定

采用凯氏定氮法测定样品中的粗蛋白质[17]。

1.3.4 酸溶蛋白的测定

采用TCA法测样品中酸溶蛋白含量[18]。

1.3.5 挥发性盐基氮的测定

采用自动凯氏定氮法测挥发性盐基氮含量[19]。

1.3.6 物料损失

比较发酵前后干物质变化，计算物料损耗。

(1)

(2)

式中：N，物料损耗，%；X1，发酵前干物质含量，%；M1，发酵前样重，g；X2，发酵后干物质含量，%；M2，发酵后样重，g；Z，酸溶蛋白提高量，%；E1，发酵前酸溶蛋白净含量，g；E2，发酵后酸溶蛋白净含量，g。

1.5 试验方法

首先研究不同菌种对小麦酒精糟固态发酵的影响，获得几株优势菌后再研究其不同组合的发酵效果，得到最佳组合后，对发酵基质组成进行优化，研究不同单因素(菌液接种量、发酵温度、发酵时间)对发酵效果的影响，再应用中心组合设计对3个单因素进行响应面优化，得到3个因素的最优组合，具体方法如下：

1.5.1 不同菌种对小麦酒精糟固态发酵的影响

先将小麦酒精糟和次粉按比例混匀，添加实验室已有饲用菌种，搅拌均匀后，装袋密封并称重。发酵培养基成分：小麦酒精糟质量分数50%，次粉质量分数50%,菌液质量分数1%,35 ℃培养箱中厌氧发酵7 d。以发酵产物中酸溶蛋白含量为考察指标，筛选出发酵效果较好的菌种。

1.5.2 不同菌种组合对小麦酒精糟固态发酵的影响

将筛选出的菌种按不同组合进行发酵，混菌发酵菌液为各菌种等比例混合，培养基同上。筛选出最优的组合菌。

1.5.3 不同发酵底物组成对小麦酒精糟固态发酵的影响

小麦酒精糟含水量在75%左右，本试验通过添加次粉来调节发酵底物的含水量，按表1中发酵底物的成分进行固体厌氧发酵，选用筛选出的组合菌种进行发酵。挑选最佳配比进行以后的混菌固态发酵试验。

表1 发酵底物组成Table 1 Composition of the substrates

1.5.4 发酵小麦酒精糟单因素试验

发酵底物成分和菌种组合根据单因素结果进行发酵，研究接种量、发酵温度、发酵时间在不同水平下对发酵结果的影响。单因素试验的不同水平见表2。

表2 单因素试验选取的不同水平Table 2 Single factor trials were selected at different levels

1.5.5 发酵小麦酒精糟响应面试验

通过单因素试验，采用经典的3因素3水平Box-Benhnken(BBD)试验设计，选取接种量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)3个因素作为优化条件的因素对象。以-1、0、+1代表变量水平，试验因素和水平见表3，通过中心组合设计，以发酵后酸溶蛋白Y为响应值，重复3次。

表3 试验设计因素水平及编码Table 3 Design of experimental factors and codes

2 结果与讨论

2.1 不同菌种对小麦酒精糟发酵效果的影响

本试验共选取15株饲用微生物进行小麦酒精糟的单菌固态发酵试验，发酵初始酸溶蛋白含量为0.75%，不同菌种对发酵产物酸溶蛋白的影响见表4，可见乳酸菌中R-02发酵产物中酸溶蛋白含量最高，显著优于其他4株乳酸菌(p<0.05)。芽孢菌中KG109发酵产物中酸溶蛋白含量最高，显著优于其他4株菌芽孢菌(p<0.05)。酵母菌发酵效果劣于乳酸菌及芽孢杆菌，可能是由于酵母菌分泌的蛋白酶较少，乳酸菌明显降低了发酵饲料的pH，改善了适口性，较低的pH可抑制有害菌的生长，有利于饲料的保存。前人研究发现，不同菌株发酵效果有所不同[20]。发酵产物的酸溶蛋白都有显著提高，表明固态发酵过程中菌株能产生蛋白酶并作用于蛋白质，将大分子蛋白质分解为动物易于吸收的酸溶蛋白[13-14]，提高产品蛋白质的品质。

表4 不同菌株对发酵结果的影响Table 4 Effects of different strains on fermentation results

注：同列数据无字母或数据肩标相同小写字母表示差异不显著(p>0.05)，不同字母表示差异显著(p<0.05)；下表同。

2.2 不同菌种组合对小麦酒精糟发酵效果的影响

乳酸菌R-02和枯草芽孢杆菌KG109两菌发酵效果最好，酵母菌中P1和P6发酵效果最优。混合菌株发酵时不同菌株之间可能会产生协同作用，较优于单菌发酵[21]，增强发酵效果[20]。因此，综合考虑，选取R-02+KG109、R-02+KG109+P1、R-02+KG109+P6进行不同菌种组合发酵试验。不同菌种组合的发酵产物中酸溶蛋白含量如表5所示，R-02+KG109双菌组合发酵产物中酸溶蛋白含量最高，发酵效果最好，显著高于3菌组合(p<0.05)。

混菌发酵有效地提高了酸溶蛋白的含量，这与彭慧慧等人[20]的研究结果相符。但是由于混菌发酵的总接种量与单菌发酵的一致，所以与单菌发酵相比，每种菌株的添加量反而降低，所以3菌混合发酵后的酸溶蛋白含量并没有高于双菌发酵的结果。枯草芽孢杆菌可产生蛋白酶、脂肪酶等活性较高的酶，可以消除小麦酒精糟中的抗营养因子，同时还可以降低蛋白质的分子质量，增加酸溶蛋白的含量[22-23]。乳酸菌发酵可降低饲料pH和氨态氮的含量，提高饲料转化率，同时产生乳酸、细菌素等多功能天然抑菌物质，从而控制大多数腐败菌及致死菌的生长[24-25]。R-02和KG109混菌发酵可能产生了互利协同作用，从而增加了酸溶蛋白的含量，提高蛋白品质。

2.3 发酵底物对小麦酒精糟发酵效果的影响

不同发酵底物组成对发酵结果的影响见表6，结合表1可知，随着发酵培养基组成的改变，含水量增加，物料损失也呈线性增加(p<0.05)。第3和4组发酵后酸溶蛋白含量最高，显著高于其他3组(p<0.05)。虽然第1组的物料损失最小(p<0.05)，但其酸溶蛋白提高量较低。发酵底物中的水分对发酵效果影响较大，水分含量过低将不利于酶的扩散，影响酶的作用效果，水分含量过高则有利于厌氧菌的生长，但对好氧菌不利，且易霉变[5]，实际生产中常选用较低的含水量。因此固体厌氧发酵时，发酵底物的含水量应控制在一个合适的范围内才有利于菌体的生长和酶的作用。第2组发酵物的酸溶蛋白含量提高量最大，物料损失较小，因此选择发酵底物组成为：小麦酒精糟38%、次粉62%。

表6 不同发酵底物成对发酵结果的影响Table 6 Effects of different media compositions on substrates

2.4 接种量对小麦酒精糟发酵结果的影响

不同菌液接种量对发酵结果的影响见表7，随着接种量的增加，酸溶蛋白含量逐渐增加(线性p<0.05，二次p<0.05)。通过提高菌液添加量，可提高菌种生长繁殖及生成代谢产物的时间，从而提高了酸溶蛋白含量[26]。当接种量为1.2%和1.4%时，发酵产物中的酸溶蛋白含量显著高于其他3组(p<0.05)。接种量对粗蛋白的影响差异不显著。随着接种量的增加，发酵产物的pH呈线性降低(线性p<0.05，二次p>0.05)，挥发性盐基氮的含量呈线性增加(线性p<0.05，二次p>0.05)。接种量过低，菌体生长迟缓，不利于一些酶及产物的生成；接种量过大，菌体繁殖过快，发酵底物的营养物质消耗过快，且副代谢产物会影响酶的合成与大分子蛋白的降解[27]。结果表明，菌液添加量为1.2%，即培养基中R-02菌液浓度为1.02×109CFU/g，KG109菌液浓度为1.68×108CFU/g时发酵效果最好。

表7 不同接种量对发酵结果的影响Table 7 Effect of different inoculation amount onfermentation results

2.5 发酵时间对小麦酒精糟发酵结果的影响

发酵时间也是固态厌氧发酵的重要参数，时间过短时菌体生长和代谢不充足，产酶较少，发酵不充分；当发酵时间过长时染菌几率增加，并且会影响工艺进程。发酵时间对小麦酒精糟发酵效果的影响如表8所示，随着发酵时间的增加，发酵产物的酸溶蛋白呈显著增加(线性p<0.05，二次p<0.05)，第6天和第7天差异不显著。当发酵时间越长，发酵产物的pH显著降低(线性p<0.05，二次p<0.05)，挥发性盐基氮的含量呈线性增加(线性p<0.05，二次p>0.05)。随着发酵时间的延长，发酵小麦酒精糟颜色逐渐加深，酸香味逐渐浓郁，这表明前期发酵以枯草芽孢杆菌的好氧发酵为主，快速消耗氧气并降解发酵基质中大分子蛋白，后期发酵以乳酸菌的厌氧发酵为主，产生大量芳香物质，改善发酵小麦酒精糟的风味。但发酵时间过长，则挥发性盐基氮含量会越来越高，且周期相应延长[26]。

表8 不同发酵时间对发酵结果的影响Table 8 Effects of different fermentation times onfermentation results

2.6 发酵温度对小麦酒精糟发酵结果的影响

每种菌都有其最适的生长温度，每种酶也都有其最适的反应温度。因此发酵时应选择合适的温度，才能达到较好的效果。不同发酵温度的发酵结果如表9所示，随着发酵温度升高，发酵产物的酸溶蛋白含量显著降低(线性p<0.05，二次p<0.05)。随着发酵温度的增加，pH值呈线性增加(线性p<0.05，二次p>0.05)，挥发性盐基氮的含量显著增加(线性p<0.05，二次p<0.05)。发酵温度会影响微生物的生长与繁殖、酶的活性及代谢产物，有研究表明发酵温度过高会产生较多挥发性盐基氮[21]，影响发酵风味。37 ℃下发酵，粗蛋白含量最低，但酸溶蛋白含量并不是最高，可能由于大量腐败菌繁殖，降解粗蛋白，产生了大量的挥发性盐基氮。结果表明，33 ℃时发酵较好，因为复合菌株包括枯草芽孢杆菌和乳酸菌，在33 ℃条件下，既能促进枯草芽孢杆菌和乳酸菌的生长，又能使菌体代谢产生的活性物质含量达到最大，从而使发酵效果达到较好。

表9 不同发酵温度对发酵结果的影响Table 9 Effects of different fermentation temperatureson fermentation results

2.7 发酵小麦酒精糟响应面优化

2.7.1 回归模型的建立及其分析

发酵小麦酒精糟酸溶蛋白的响应面结果见表10。采用Design Expert 8.0.5.0软件中的BBD对试验结果进行响应面分析，得到回归模型方差分析表，结果如表11和表12所示。由表11可知，模型的一次项ABC，交互项BC，各二次项影响均极显著。各因素的贡献率为C>B>A，即发酵时间>发酵温度>接种量。

通过多元回归拟合分析得到酸溶蛋白与各变量(接种量、发酵温度、发酵时间)的二次多项式方程：

Y=4.22+0.057A+0.11B+0.21C+0.043BC-0.28A2-0.16B2-0.15C2。

对上述模型方程的方差分析表明，本试验模型p<0.000 1，说明二次回归模型是极显著的。由表12可知，回归方程因变量与自变量之间的线性关系显著，相关系数R2=0.994 8，说明此模型能解释99.48%响应值变化；变异系数较低(0.71%)，说明试验重复性较好。根据方差分析(表11)可知，失拟项不显著(p=0.43>0.1)，说明模型与实际试验拟合程度好，预测值和实际值之间具有高度的相关性，数据中无异常点，模型适当，分析结果可靠，可以应用于小麦酒精糟发酵的理论预测。

表10 Box-Benhnken响应面试验设计及结果Table 10 Box-Benhnken response surface design and results

表11 响应面结果方差分析 Table 11 Analysis of variance of experimental results of response surface

注：*表示统计结果显著，**表示统计结果极显著。

表12 二次回归方程的方差分析Table 12 Analysis of variance of the quadratic model

2.7.2 响应曲面优化分析

利用 Design Expert 8.0.5.0 软件对回归模型进行规范分析，根据回归方程，可得到接种量、发酵温度及发酵时间3个因素交互影响发酵小麦酒精糟酸溶蛋白的等高线图和相应的响应面分析图，如图1～图3所示。图1、图2、图3分别表示接种量、发酵温度及发酵时间3个因素中1个因素取0点时其余2个因素对酸溶蛋白含量的影响。

通过二次多项回归方程所作响应曲面图及其等高线图，可以直观地反映出发酵条件对酸溶蛋白的影响，等高线的形状可揭示出各因素之间交互效应的强弱大小，椭圆形表示2个因素交互作用显著，而圆形则相反。由图1可以看出，酸溶蛋白随着菌液接种量的增加先上升后下降，随发酵温度的升高，亦先上升后逐渐下降，等高线的形状为圆形，说明菌液接种量和发酵时间交互作用不显著。由图2可以看出，随着发酵时间和菌液接种量的增加，酸溶蛋白呈先上升后下降的趋势，等高线的形状为圆形，说明菌液接种量和发酵时间交互作用不显著。由图3可以看出，二者交互作用形成的曲面为抛物面，说明发酵时间和发酵温度之间存在交互作用。综上可以看出，接种量(A)、发酵温度(B)和发酵时间(C)存在极值点，通过该组动态图即可确定各个因素的最佳水平范围。根据 Design Expert 8.0.5.0软件对试验结果进行最优化分析，确定最佳的发酵条件为：菌液接种量为1.22%，发酵温度33.45 ℃，发酵时间为6.78 d，在此条件下预测发酵小麦酒精糟的酸溶蛋白含量为4.33%。

图1 发酵温度和接种量对酸溶蛋白含量影响的等高线及响应曲面图Fig.1 Response surface and contour graph of the effects of fermentation temperature and inoculation amount on content of acid soluble protein

图2 发酵时间和接种量对酸溶蛋白含量的等高线及响应曲面图Fig.2 Response surface and contour graph of the effects of fermentation time and inoculation amount on content of acid soluble protein

图3 发酵时间与发酵温度对酸溶蛋白含量的等高线及响应曲面图Fig.3 Response surface and contour graph of the effects of fermentation time and fermentation temperature on content of acid soluble protein

2.7.3 模型的验证

采用模型预测最佳优化条件，菌液接种量为1.22%，发酵温度33.4 ℃，发酵时间为6.78 d，在该条件下进行小麦湿酒精糟的发酵试验，重复3次，每次酸溶蛋白含量分别为4.29%，4.33%和4.34%，平均酸溶蛋白含量为4.32%，与理论预测值的相对误差约为0.06%。其他各项指标差异如表13所示，可见，发酵小麦酒精糟可有效提高其适口性和营养价值。粗蛋白质含量由13.67%提高到13.75%(p<0.05)，酸溶蛋白由0.74%提高到4.32%(p<0.05)，挥发性盐基氮含量由10.45 mg/100 g升高到45.43 mg/100 g(p<0.05)，pH值由5.38降低到3.98(p<0.05)，益生菌由6.95×107CFU/g提高到5.48×109CFU/g(p<0.05)，蛋白酶活性由72.10 U/g提高到196.14 U/g(p<0.05)。说明构建的模型可以很好地预测混菌固态发酵小麦酒精糟的过程。

表13 小麦酒精糟发酵前后营养价值变化Table 13 Changes in nutritional value before and afterfermentation of wheat distiller's grains

注：同行数据不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

3 结论

本试验以提高酸溶蛋白为目标，筛选出枯草芽孢杆菌KG109和乳酸菌R-02两株高效菌株；发酵基质组成为：35%小麦酒精糟和65%次粉；最佳固态厌氧发酵条件为：菌液接种量为1.22%，发酵温度33.4℃，发酵时间为6.78 d，在该条件下小麦酒精糟发酵产物的平均酸溶蛋白含量可达到4.32%。试验表明固态发酵工艺对小麦酒精糟品质具有提升作用。

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