α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在毕赤酵母中的表达及其对大麦麦芽过滤性能的影响

解西柱，张明，林材，蔡国林，吴殿辉，李晓敏，陆健*

1 (江南大学，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122) 2 (江南大学，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡，214122) 3 (江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122) 4(江苏省农垦麦芽有限公司，江苏 射阳，224300) 5 (华润雪花啤酒有限公司，河北 秦皇岛，066001)

阿拉伯木聚糖(arabinoxylans，AX )是半纤维素的主要成分，其基本结构是以β-(1→4)-D吡喃木糖残基为线形骨架，同时在C(O)-3，(O)-2或C(O)-2，3键联上α-L-阿拉伯呋喃糖残基为侧链取代基[1]。AX的降解需要多种酶的协同作用，如内切β-木聚糖酶、外切β-木聚糖酶、β-木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶等[2-3]。在大麦麦芽中AX的含量为3.1%～4.0%，水溶性阿拉伯木聚糖(water-extractable arabinoxylans, WEAX)的含量为0.49%～0.69%[4]。AX的存在在麦汁的制造过程中会产生很多问题，尤其是多聚阿拉伯木聚糖(polymeric arabinoxylans, PAX)，比如降低麦汁的过滤速度，增加麦汁的黏度等[5]。但在AX的降解过程中，L-阿拉伯呋喃糖残基的存在阻碍了其他水解酶与AX的有效结合，进而降低了水解酶对AX的降解效率，影响麦汁的过滤性能[6-7]。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Arabinofuranosidase, AnabfA)存在于糖基水解酶的第3、43、51、54、62和127家族[8]。它可特异性地从L-阿拉伯糖多糖或寡糖残基的非还原末端α-L-1,2-，α-L-1,3-和α-L-1,5-位点水解生成1个阿拉伯糖[9-11]。AnabfA已经在一些细菌、真菌和植物中获得，但由于酶活较低，不具备工业化应用价值。目前，国内外一些研究人员已经在大肠杆菌和酵母等菌株中进行异源表达，在国内，薛业敏等首次实现了在大肠杆菌中对AnabfA的异源表达[12]，获得耐热性较好的阿拉伯糖苷酶。而且，国内外研究人员也实现了AnabfA在酵母中的异源表达[13-17]，但酶学性质及酶活存在较大的差异。目前，国内外对AnabfA的研究重视程度不够，尚未有商品化的酶问世，而且对AnabfA的应用研究也比较少。

本研究从NCBI上查询获得黑曲霉AnabfA的基因序列，通过PCR技术从黑曲霉基因组中扩增获得AnabfA的基因。构建重组质粒pPICZαA-QAnabfA，并在毕赤酵母X-33中诱导表达，研究重组AnabfA的酶学性质及其对大麦麦芽过滤性能的影响，为AnabfA的工业应用提供重要的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

AspergillusnigerCBS513.88，PichiapastorisX-33，E.coliJM109均由本实验室保藏；质粒pMD18-T simple vector，pPICZαA均购自于TaKaRa公司。

1.1.2 主要酶、试剂

肽N-糖苷酶F，O-Glycosidase购于New England Biolabs(NEB)公司，DNA限制性内切酶，T4DNA连接酶，rTaq酶，高保真DNA聚合酶，质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒，购于TaKaRa公司；博莱霉素(zeocin)，蛋白质Marker ，购于BBI生命科学有限公司；对硝基苯阿拉伯呋喃糖苷(4-Nitrophenyl α-L-arabinofuranoside， 简称pNPAF)购于Sigma公司；木聚糖酶(xylanase, Xyn)购于白银赛诺生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器

琼脂糖凝胶电泳仪， 美国Bio-Rad公司；JD-801凝胶成像仪，江苏省捷达科技发展有限公司；Spectra Max Plus 384酶标仪，美国MDC公司；HisTrapTMexcel(1 mL)色谱柱，GE Healthcare公司；Mastercycler pro PCR仪，德国Eppendorf公司，EBC-LF麦芽标准粉碎机，北京德之杰公司；WGZ-2-PJ浊度计，上海昕瑞仪器仪表有限公司；黏度计，Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉AnabfA基因的分析与克隆

利用液氮研磨的方法[18]提取黑曲霉的基因组。从GenBank查询获得AnabfA的基因序列，利用信号肽预测软件SignaIP 3.0在线预测AnabfA的信号肽序列，设计引物P1、P2、P3、P4，引物序列如表1所示。以黑曲霉的基因组为模版，利用重叠PCR技术去除AnabfA的信号肽、内含子和终止密码子序列获得目的基因片段QAnabfA[19-20]。将QAnabfA与T载体pMD18-T连接得到重组质粒QAnabfA-T，并转化E.coliJM109进行保藏。

表1 PCR反应引物Table 1 PCR priers

1.2.2 重组表达质粒的构建

EcoR I和NotI对质粒pPICZαA和QAnabfA-T进行双酶切，T4DNA连接酶连接双酶切产物，构建重组表达质粒pPICZαA-QAnabfA (图1)。EcoR I和NotI对阳性转化子质粒进行双酶切验证，验证其是否正确连接。

图1 重组表达质粒pPIZαA-QAnabfA的构建图谱Fig.1 Construction of recombinant expression plasmid pPIZαA-QAnabfA

1.2.3 重组AnabfA的诱导表达及其分离纯化

通过电转化的方法分别把重组表达质粒pPICZαA-QAnabfA和空载表达载体pPICZαA转入到毕赤酵母X-33中，筛选获得重组子。用培养基BMGY对重组子进行扩大培养，用培养基BMMY对重组子进行发酵培养，取发酵4 d后的发酵液离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达情况。电转化方法、重组子的筛选和发酵条件参照Invitrogen 公司的毕赤酵母菌实验操作手册。

利用镍柱亲和层析的方法对重组酶进行纯化并对纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE检测，分析蛋白纯化的效果和重组蛋白分子质量。

1.2.4 重组AnabfA的酶活检测

酶活测定的反应体系：25 μL 4 mmol/LpNPAF溶液，50 μL 0.1 mol/L pH 5.5醋酸钠缓冲液，25 μL酶溶液。反应条件：将反应体系置于50 ℃的水浴锅中反应15 min，反应结束后迅速加入100 μL 1 mol/L Na2CO3终止反应。空白对照：将酶液在沸水浴中灭活10 min做空白对照。将终止反应的反应体系静置15 min后，用酶标仪测410 nm下的吸光值，根据对硝基苯酚制作的标准曲线，计算出样品中对硝基苯酚的含量。酶活的定义：每分钟产生1 μmol/L的对硝基苯酚所需的酶量为1个酶单位。以Bradford 测定发酵液蛋白质的浓度[21]，从而测定酶的比活。

1.2.5 重组AnabfA的酶学性质研究

酶的最适温度及其温度稳定性：在pH 5.5的条件下，用酶标仪测定酶在不同温度(30、35、40、45、50、55、60、65 ℃)下的酶活，以测得的最高酶活为100%，计算其他温度下的相对酶活，将酶在上述各温度下保温30 min后，测定残余酶活。

酶的最适pH及其pH稳定性：用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制不同pH(2.4、3、3.4、4、4.4、5、5.4、6、6.4、7、7.4、8)的pNPAF溶液，在50 ℃的条件下测定不同pH条件下的相对酶活，把酶液在上述不同pH条件下处理30 min后，测定其残余酶活。

金属离子对重组AnabfA活性的影响：以不加金属离子的酶液为对照，在终浓度为1 mmol/L的金属离子(K+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Al3+)的溶液中测定这些金属离子对酶活性的影响。

重组AnabfA的动力学研究：将纯化的酶加入到含有不同底物浓度对硝基苯阿拉伯呋喃糖苷(0.187 5～1.87 5 mmol/L)中，在pH 5.5，温度50 ℃下反应10 min，计算初始反应速度。利用Lineweavere-Burk plot法计算获得Km值和Vmax值。

1.2.6 重组AnabfA的糖基化修饰分析

用NetNGlyc 1.0 Server和NetOGlyc 4.0 Server对酶的糖基化水平及其糖基化位点进行分析。用去糖基化酶PNGase F和O-Glycosidase对重组酶进行处理，并对处理前后的酶进行SDS-PAGE分析。

1.2.7 重组AnabfA对麦汁过滤性能的影响及其与木聚糖酶的协同作用

取50 g经EBC粉碎机粉碎的单二大麦麦芽于糖化杯中，加入200 mL去离子水和31.2 mU/g绝干麦芽重组AnabfA进行协定糖化(图2)。糖化结束后，在10～15 min内使醪液冷却至室温，用去离子水使糖化杯中的内容物定重为450 g，将糖化醪搅拌均匀，并用中速滤纸过滤，将最初收集的100 mL滤液返回重滤，收集滤液，即为协定麦汁。测定麦汁的过滤速度、黏度、浊度、 AX和PAX含量。过滤速度：从最初收集的100 mL滤液返回重滤开始计时，30 min内过滤出多少体积的麦汁，即为过滤速度。麦汁的浊度采用EBC浊度计直接读数[22]。麦汁的黏度采用落球计黏度测定法[22]。PAX为麦汁80%的乙醇沉淀物[4]，用Douglas法测定AX和PAX的含量[23]。

图2 糖化曲线Fig.2 Curve of saccharification

测定重组AnabfA与木聚糖酶同时作用和连续作用于底物的协同能力。反应底物：大麦阿拉伯木聚糖，从单二大麦麦芽中提取[4]。反应在0.1 mol/L的醋酸盐缓冲液和50 ℃恒温水浴锅中进行，反应总体系为10 mL，重组AnabfA 0.067 U/mL，木聚糖酶333 U/mL，阿拉伯木聚糖2 mg/mL。对照组：以不加酶只加底物的反应体系为空白对照。

同时作用：重组AnabfA与木聚糖酶同时作用于底物，反应时间4 h，测定产生还原糖的量。连续作用：先用一种酶(重组AnabfA或木聚糖酶)作用与底物，反应4 h后，在沸水浴中灭活10 min，再加入另一种酶(木聚糖酶或重组AnabfA)反应4 h，测定产生还原糖的量。协同能力：重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶同时或连续作用于底物产生还原糖的量与两种酶分别单独作用于底物产生的还原糖量之和的比值。

保护绿水青山，古已有之。历史经验告诉我们，人类与自然是密不可分的。保护自然便是保护人类自己，“斧斤以时入山林”的古训，一语千年传递尊重自然的声音。“天人合一”，“道法自然”的哲理，一语中的传承顺应自然的声音。人类只有尊重自然，顺应自然，才能真正做到保护自然，保护自己。我国古人的敦敦教诲，仍以持续的精神力量，指导我们的生活。

2 结果与讨论

2.1 AnabfA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

2.1.1 AnabfA基因的克隆

黑曲霉AnabfA在NCBI上Gene ID为4982505，以黑曲霉的基因组DNA为模版，通过PCR对AnabfA序列进行扩增，得到1 790 bp的目的基因。通过比对，目的基因与NCBI上报道的AnabfA的相似度为100%。

根据信号肽预测结果，AnabfA N端含有18个氨基酸的信号肽。在NCBI上查找得到AnabfA只有1个50 bp的内含子序列，通过重叠PCR去除AnabfA的信号肽、内含子和终止密码子序列获得目的基因QAnabfA。基因测序结果显示QAnabfA序列长度为1 683 bp ，信号肽、内含子和终止密码子序列完全去除。

2.1.2 重组表达质粒pPICZαA-QAnabfA的构建及其在毕赤酵母中的诱导表达

将基因片段QAnabfA与表达载体pPICZαA进行连接，得到重组表达质粒pPICZαA-QAnabfA，NotI 与EcoR I 对pPICZαA-QAnabfA进行双酶切验证，酶切条带大小符合，表明目的条带与载体连接正确。重组表达载体pPICZαA-QAnabfA与空载表达载体pPICZαA通过电转化的方法分别转入毕赤酵母X-33，并通过筛选得到重组菌株与空载重组子。

利用BMGY和BMMY培养基对重组菌株和空载重组菌株进行发酵培养，取发酵4 d后的培养液的上清液，进行SDS-PAGE检测，结果见图3，泳道3、4比泳道1、2在预期的位置多出了1条明亮的条带，说明重组菌株已经得到成功的表达。

M-标准蛋白Marker； 1、2-空载重组菌发酵上清液； 3、4-重组菌发酵上清液图3 重组菌株发酵液SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant strain fermentation supernatants

2.2 重组AnabfA的分离纯化与酶学性质的研究

2.2.1 重组AnabfA的分离纯化及其去糖基化分析

用镍柱亲和层析的方法对重组蛋白进行纯化，将纯化后的酶液进行SDS-PAGE鉴定，结果(图4)显示，泳道3只有1条100 kDa左右的蛋白质条带，说明纯化效果良好，但蛋白条带弥散，明显高于目的蛋白分子质量的理论大小70 kDa，这可能是由于毕赤酵母中蛋白质的糖基修饰化作用。蛋白质糖基化预测软件对重组AnabfA的氨基酸序列分析，结果显示，重组AnabfA氨基酸条带上有9个N糖基化位点和5个O糖基化位点，用酶PNGase F和O-Glycosidase切除重组AnabfA的糖基化侧链，进行SDS-PAGE鉴定，结果如图5所示，泳道2中103 kDa和36 kDa处的条带分别为酶O-Glycosidase和PNGase F的条带，因此70 kDa处的条带为目的蛋白条带，符合理论值大小。

M-标准蛋白Marker； 1、2-未纯化的酶液；3-纯化的酶液图4 重组AnabfA纯化后SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE Analysis of purified recombinant AnabfA

M-标准蛋白Marker； 1-糖基化酶处理后的酶液；2-未经糖基化酶处理的酶液图5 重组AnabfA经糖基化酶处理后的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE Analysis of recombinant AnabfA after glycosylase treatmen

2.2.2 温度和pH对重组AnabfA活性的影响

图6 温度对重组AnabfA活力及其稳定性的影响Fig.6 Effects of temperature on the activity and stability of recombinant AnabfA

图7 pH对重组AnabfA活力及其稳定性的影响Fig.7 Effects of pH on the activity and stability of recombinant AnabfA

2.2.3 金属离子对重组AnabfA活性的影响

Cu2+、Zn2+和Fe2+对重组AnabfA的酶活有抑制作用，相对酶活力只有对照的17%、8%、80%；Fe3+对重组AnabfA的酶活有促进作用，相对酶活为对照的131%； Ni2+、K+、Al3+、Co2+、Mn2 +和Mg2+对其酶活几乎没有影响(图8)。

2.2.4 重组AnabfA的动力学

图8 金属离子对重组AnabfA酶活的影响Fig.8 Effects of metal ions on the activity of recombinant AnabfA

根据AnabfA在不同浓度pNPAF(0.187 5～1.875 mmol/L)下，计算得到初始反应速度。利用Lineweavere-Burk plot法计算获得酶促反应参数Km值和Vmax值分别为0.78 mmol/L和2.57 μmol/(min·mg)。

2.3 重组AnabfA在麦汁制造中的应用研究

2.3.1 重组AnabfA对麦汁过滤性能的影响

在大麦麦芽糖化的初始阶段添加重组AnabfA，测定糖化结束后获得的麦汁的相关指标，结果见表2。麦汁的过滤速度提高了12.8%，黏度降低了2.4%，浊度提高了2.3%。麦汁中AX的含量增加，PAX的含量减少，表明重组AnabfA可以使水不溶性的阿拉伯木聚糖部分溶解，同时也促进了麦汁中PAX的降解。PAX的降解可以降低麦汁的黏度，提高麦汁的过滤速度。

表2 重组AnabfA对麦汁过滤性能的影响Table 2 Effect of recombinant AnabfA on the filterability of wort

2.3.2 重组AnabfA与木聚糖酶的协同作用

将木聚糖酶和重组AnabfA按不同的组合方式作用于大麦麦芽木聚糖，反应结束后测定产生还原糖的量，结果见表3，当重组AnabfA和木聚糖酶同时作用于木聚糖时，协同能力为113%；当先加AnabfA再加木聚糖酶作用于木聚糖时，协同能力为122%，当先加木聚糖酶再加AnabfA作用于木聚糖时，协同能力124%。这说明当以大麦麦芽木聚糖为底物时，AnabfA和木聚糖酶具有良好的协同作用，并且这两种酶对木聚糖的降解是相互促进的。进一步证明在麦芽糖化的过程中，重组AnabfA可以与麦芽本身的木聚糖酶通过协同作用促进麦汁中PAX的降解。

表3 重组AnabfA和木聚糖酶降解大麦麦芽木聚糖的协同作用Table 3 Synergistic action of endoxylanase andrecombinant AnabfA on and barley malt arabinoxylan

3 结论

对黑曲霉的AnabfA进行克隆并在毕赤酵母中进行高效表达，重组AnabfA用镍柱进行分离纯化，分子质量为70 kDa，最适反应温度和最适pH分别为50 ℃和5.5；在55 ℃以下，pH3.5～5.5 稳定性较好。Cu2+、Zn2+和Fe2+对重组AnabfA的酶活有抑制作用，Fe3+对重组AnabfA的酶活有促进作用，酶促反应参数Km值和Vmax值分别为0.78 mmol/L和2.57 μmol/(min·mg)。重组AnabfA和木聚糖酶对大麦麦芽阿拉伯木聚糖的降解有较好的协同作用，可以降低麦汁中PAX的含量，从而降低了麦汁的黏度，提高了麦汁的过滤速度。在大麦麦芽协定糖化的初始阶段添加重组AnabfA，添加量为31.2 mU/g，麦汁的黏度降低了2.3%，麦汁的过滤速度提高了12.8%，该结果为AnabfA的工业应用提供了重要的理论参考。

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