高效液相色谱/电喷雾-离子阱-飞行时间质谱联用法分析桂枝汤的化学成分Δ

袁鹏飞，张 雯，徐 风，刘广学，尚明英，蔡少青

(北京大学药学院， 北京 100191)

桂枝汤是中医常用方剂，来源于张仲景的《伤寒论》，由桂枝、白芍、炙甘草、生姜和大枣等5味中药组成，具有解肌发表、调和营卫之功效，用于治疗外感风寒表虚证。桂枝汤的主要有效成分为苯丙烯类化合物，周硕等[1-2]采用化学分离的方法从桂枝汤中分离鉴定了桂皮醛、桂皮醇等15种化合物；曹进等[3]采用液相色谱质谱联用方法对桂枝汤A部分的主要色谱峰与对应的各单味药材进行了归属，但未鉴定化合物的结构；陈璐琳[4]采用液相色谱质谱联用方法对桂枝汤进行化学成分分析，鉴定了144种化合物并对其来源药材进行了归属。桂枝汤中主要成分原儿茶酸、香豆素、芍药苷、甘草苷、肉桂酸和桂皮醛的含量已有文献报道[5-7]。本课题组前期采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法测定了桂枝汤中没食子酸、芍药苷、芍药内酯苷、甘草苷、香豆素、桂皮酸、桂皮醛、2-甲氧基桂皮醛和甘草酸等9种主要成分以及桂枝汤君药桂枝中2-羟基肉桂酸、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、肉桂醛和2-甲氧基肉桂醛等7种苯丙素类成分的含量[8-9]，并采用HPLC法对桂枝化学成分进行指纹图谱研究，指认了3-羟基桂皮酸、2-羟基桂皮酸、4-羟基-3-甲氧基桂皮醛、2-羟基桂皮醛、香豆素、桂皮醇、桂皮酸、2-甲氧基桂皮酸、桂皮醛和2-甲氧基桂皮醛等10种化学成分[10]。为了全面认识桂枝汤的化学成分组成，本实验采用HPLC/电喷雾-离子阱-飞行时间质谱联用(HPLC/electrospray ionization-ion trap-time-of-flight mass spectrometry，HPLC-ESI-IT-TOF-MSn)法对桂枝汤进行了分析，根据精确的分子量信息及质谱裂解规律进行解析，并与对照品对照或参考相关文献数据，指认了桂枝汤中51种化合物，其中20种化合物为桂枝汤中首次报道，现报告如下。

1 材料

1.1 仪器

Shimadzu LC-ESI-IT-TOF-MS系统(日本岛津公司)，包括LC-20AD 输液泵、SIL-20AC自动进样器、CTO-20AC柱温箱、SPD-M20 A二极管阵列检测器、CBM-20 A控制器、DGU-20A3在线脱气机和ESI-IT-TOF-MS电喷雾电离-离子阱-飞行时间串连质谱仪；BP211D型十万分之一电子天平(德国Sartorius公司)；AR1140型万分之一电子天平(美国OHAUS公司)；Milli-Q超纯水制备仪(美国Millipore公司)。

1.2 药品与试剂

1.2.1 药材：桂枝(编号：6550)，产地广西；灸甘草(编号：6552)，产地内蒙古；以上2味药材购自北京同仁堂崇文门药店。白芍(编号：6554)，产地安徽，购自北京花园路联康药店。生姜、大枣购自北京海淀区花园北路超市发朗秋园店。以上药材经北京大学药学院尚明英副教授鉴定，桂枝为樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl.的干燥嫩枝，白芍为毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根，灸甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根茎的蜜炙品，生姜为姜科植物姜ZingiberofficinaleRose.的新鲜根茎，大枣为鼠李科植物枣ZiziphusjujubaMill.的干燥果实。凭证标本保存于北京大学药学院生药学标本室。

1.2.2 对照品：没食子酸(批号：100702)；(+)-儿茶素(批号：110202)；甘草苷(批号：90108)；香豆素(批号：100606)；异甘草苷(批号：91026)；异甘草素(批号：90416)；丹皮酚(批号：100523)；甘草素(批号：90907)；甘草酸(批号：91204)；甘草次酸(批号：101004)；均购自成都曼思特生物科技有限公司。羟基芍药苷(批号：20100923)；芍药内酯苷(批号：20100722)；苯甲酰芍药苷(批号：20100715)；均购自上海展舒化学科技有限公司。桂皮醇(批号：A0198694，Acros)；桂皮酸(批号：A0218853001，Acros)；2-甲氧基桂皮酸(批号：A019482701，Acros)；桂皮醛(美国Acros公司，批号：A0295155)；2-甲氧基桂皮醛(批号：S07070-195，Aldrich)；均购自北京百灵威科技有限公司。苯甲酸(批号：100419-200301)，购自中国药品生物制品检定所。芍药苷为课题组从赤芍中分离纯化，经核磁、质谱等波谱技术鉴定结构。经HPLC-二极管阵列检测器测定，异甘草苷纯度为95%，其余对照品纯度均≥98%(峰面积归一化法)。

1.2.3 试剂：乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国Mreda公司)；超纯水(Milli-Q仪制备)。

2 方法与结果

2.1 液相条件

色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速1.0 ml/min；进样量10 μl；检测波长200～700 nm；柱温25 ℃。以0.1%甲酸水溶液为流动相A、乙腈为流动相B进行梯度洗脱(0 min，5%B；10 min，13%B；15 min，13%B；35 min，18%B；40 min，18%B；45 min，20%B；80 min，31%B；85 min，31%B；95 min，36%B；100 min，50%B；100 min，100 %B；120 min，100%B；125 min，5%B)。

2.2 质谱条件

质谱检测条件为ESI离子源，采集范围一级质谱m/z100～1 000，二级质谱m/z50～1 000，自动母离子选择模式；离子累积时间30 ms；接口电压：(+)4.5 kV，(-)-3.5 kV；雾化气流速1.50 L/min；曲型脱溶剂管温度200 ℃；检测器电压1.70 kV；碰撞诱导解离能量50%。

2.3 对照品溶液的制备

称取对照品适量，以甲醇为溶剂，分别配成没食子酸420.0 μg/ml、羟基芍药苷1 029.0 μg/ml、(+)-儿茶素408.8 μg/ml、芍药内酯苷1 018.0 μg/ml、芍药苷3 351.0 μg/ml、甘草苷1 012.0 μg/ml、苯甲酸1 054.0 μg/ml、香豆素1 011.0 μg/ml、桂皮醇1 316.0 μg/ml、异甘草苷1 070.0 μg/ml、甘草素1 058.0 μg/ml、桂皮酸997.0 μg/ml、桂皮醛2 517.0 μg/ml、2-甲氧基桂皮酸1 093.0 μg/ml、苯甲酰芍药苷1 023.0 μg/ml、丹皮酚477.6 μg/ml、2-甲氧基桂皮醛1 754.0 μg/ml、异甘草素1 013.0 μg/ml、甘草酸438.0 μg/ml和甘草次酸406.4 μg/ml的对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

根据处方分别取桂枝9 g、白芍9 g、炙甘草6 g、生姜9 g和大枣9 g，煎煮2次，第1次煎煮加入8倍量的去离子水，浸泡30 min，煎煮30 min，两层纱布过滤；第2次煎煮加入6倍量的水，煎煮30 min，两层纱布过滤。合并2次煎煮液，减压浓缩后放至室温(20 ℃)，稀释至200 ml，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。同样方法制备各单味药的供试品溶液。

2.5 桂枝汤的HPLC-ESI-IT-TOF-MSn分析结果

按上述色谱及质谱条件项下的检测方法，对桂枝汤水煎液进行HPLC-ESI-IT-TOF-MSn分析，结果见图1—2。

A.桂枝汤对照品；B.桂枝汤水煎液A.Guizhi decoction control substance；B.Guizhi decoction图1 桂枝汤对照品和水煎液的HPLC图(波长为254 nm)Fig 1 HPLC of Guizhi decoction control substance and Guizhi decoction(with wavelength of 254 nm)

2.6 桂枝汤中主要化学成分的质谱裂解规律及结构解析

通过离子阱-飞行时间液质联用法指认了桂枝汤中51种化合物，并给出了可能的分子式，其中通过对照品确认的化合物有20种，分别为没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、苯甲酸、香豆素、桂皮醇、异甘草苷、异甘草素、桂皮酸、桂皮醛、2-甲氧基桂皮酸、苯甲酰芍药苷、丹皮酚、2-甲氧基桂皮醛、甘草素、甘草酸和甘草次酸。分析结果与各化合物的质谱数据见表1。部分化合物的结构解析如下：

A.桂枝汤对照品；B.桂枝汤水煎液A.Guizhi decoction control substance；B.Guizhi decoction图2 桂枝汤对照品和水煎液的总离子流图Fig 2 Total ion chromatogram of Guizhi decoction control substance and Guizhi decoction

2.6.1 化合物2(tR=8.33 min)的结构分析：一级质谱图给出准分子离子峰为m/z559.117 1([M-H]-)，预测分子式为C23H28O14S。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)为513.106 4[M-H-HCOOH]-、421.080 8[M-H-pOHBA]-、375.078 7[M-H-pOHBA-HCOOH]-、259.029 9[M-H-pOHBA-Glc]-和213.023 2[M-H-HCOOH-pOHBA-Glc]-(pOHBA=4-羟基苯甲酸)。以上信息符合氧化芍药苷亚硫酸酯的裂解规律(见图3)，并与文献[11]报道数据基本一致。因此，推测2号峰为氧化芍药苷亚硫酸酯。

表1 桂枝汤中指认的化学成分及其质谱数据Tab 1 The identified chemical constituents and MS data of Guizhi decoction

续表1

编号保留时间/min分子式离子类型测定分子量/(m/z)误差/ppm特征碎片离子化合物名称1838118C7H6O2[M⁃H]-12103101652苯甲酸a1945643C30H32O15[M⁃H]-631167604651421[M⁃H⁃BA⁃CO2]-，3130567[GA+Glc⁃H⁃H2O]-没食子酰芍药苷及其异构体b[13⁃14]2046728C21H22O10[M⁃H]-43311641622710614[M⁃H⁃Glc]-5⁃羟基甘草苷[12]2147148C9H6O2[M+H]+14704460681030498[M+H⁃CO2]+香豆素a2248373C23H28O11[M+HCOO]-52516480194791576[M⁃H]-，3571215[M⁃H⁃BA]-，2830806[BA+Glc⁃H2O⁃H]-异芍药苷或芍药内酯苷R1b[11]2349948C9H8O3[M+H⁃H2O]+14902521341210301[M+H⁃CO]+，1080497[M+H⁃C2O]+，910023[M+H⁃C2O⁃H2O]+2⁃羟基桂皮醛b[15]2451768C30H32O14S[M⁃H]-647141505251080[M⁃H⁃BA]-，4791025[M⁃H⁃BA⁃HCOOH]-，3810646[M⁃H⁃BA⁃Glc]-，2590275[M⁃H⁃2BA⁃Glc]-，2130233[M⁃H⁃2BA⁃Glc⁃HCOOH]-苯甲酰芍药苷亚硫酸酯[11]2555758C9H10O[M+H⁃H2O]+1170702-171桂皮醇a2657123C21H22O9[M⁃H]-4171205-0482550651[M⁃H⁃Glc]-，1350130[M⁃H⁃C8H8O]-异甘草苷a2762513C15H12O4[M⁃H]-2550656-0391350113[M⁃H⁃C8H8O]-，1190558[M⁃H⁃C8H8O2]-异甘草素a2864403C9H8O2[M+H]+1490245-7381310441[M+H⁃H2O]+，930222[M+H⁃H2O⁃CO]+桂皮酸a2970388C42H64O16[M⁃H]-82341342197613988[M⁃H⁃H2O⁃CO2]-，6473780[M⁃H⁃Glucuronicacid]-，4713504[M⁃H⁃2Glucuronicacid]-，3510557[2Glucuronicacid⁃2H2O⁃H]-，2890553[2Glucuronicacid⁃3H2O⁃CO2]-甘草皂苷J2[12]3070878C9H8O[M+H]+133065301150477[M+H⁃H2O]+桂皮醛a3174098C10H10O3[M+H]+179068902⁃甲氧基桂皮酸a3276198C30H32O12[M⁃H]-5831766-0865531689[M⁃H⁃HCHO]-，4311336[M⁃H⁃HCHO⁃BA]-苯甲酰芍药苷a3376233C42H62O16[M⁃H]-82140271467593882[M⁃H⁃H2O⁃CO2]-，6453689[M⁃H⁃Glucuronicacid]-，3510544[2Glucuronicacid⁃2H2O⁃H]-，2890585[2Glucuronicacid⁃3H2O⁃CO2]-甘草皂苷H2或K2b[12]3478298C48H72O21[M⁃H]-98344901737594095[M⁃H⁃Glc⁃H2O⁃CO2]-，6453656[M⁃H⁃Glucuronicacid⁃Glc]-，4693362[M⁃H⁃2Glucuronicacid⁃Glc]-，3510579[2Glucuronicacid⁃2H2O⁃H]-甘草皂苷A3[12]3579733C9H10O3[M+H]+1670714-061490598[M+H⁃H2O]+丹皮酚a，b3682218C42H60O17[M⁃H]-8353785-067913852[M⁃H⁃CO2]-，6593379[M⁃H⁃Glucuronicacid]-，3510564[2Glucuronicacid⁃2H2O⁃H]-，2890539[2Glucuronicacid⁃3H2O⁃CO2]-23⁃羟基甘草皂苷E2b[12]3782568C42H62O17[M⁃H]-83739282277753933[M⁃H⁃H2O⁃CO2]-，6613579[M⁃H⁃Glucuronicacid]-，4853294[M⁃H⁃2Glucuronicacid]-，3510555[2Glucuronicacid⁃2H2O⁃H]-，2890560[2Glucuronicacid⁃3H2O⁃CO2]-甘草皂苷G2[12]3882918C44H64O18[M⁃H]-87940760346433455[M⁃H⁃Glucuronicacid⁃Acetoxyl]-，4233288[M⁃H⁃2Glucuronicacid⁃Acetoxyl⁃CO2]-，3510573[2Glucuronicacid⁃H⁃2H2O]-，2890566[2Glucuronicacid⁃H⁃3H2O⁃CO2]-22β⁃乙酰基甘草酸b[12]3986348C10H10O2[M+H]+1630751-4911450672[M+H⁃H2O]+2⁃甲氧基桂皮醛a4091178C42H62O17[M⁃H]-83739120367753899[M⁃H⁃H2O⁃CO2]-，6613584[M⁃H⁃Glucuronicacid]-，4853287[M⁃H⁃2Glucuronicacid]-，3510575[2Glucuronicacid⁃2H2O⁃H]-，2890552[2Glucuronicacid⁃3H2O⁃CO2]-甘草皂苷G2异构体b[12]4191808C42H60O16[M⁃H]-8193843-0737573786[M⁃H⁃H2O⁃CO2]-，6433532[M⁃H⁃Glucuronicacid]-，4673246[M⁃H⁃2Glucuronicacid]-，3510548[2Glucuronicacid⁃2H2O⁃H]-，2890568[2Glucuronicacid⁃3H2O⁃CO2⁃H]-甘草皂苷E2b[12，16]4292350C15H12O4[M⁃H]-25506580391350119[M⁃H⁃C8H8O]-，1190135[M⁃H⁃C8H8O2]-甘草素a4392718C42H60O16[M⁃H]-819381106433386[M⁃H⁃Glucuronicacid]-，3510559[2Glucuronicacid⁃2H2O⁃H]-，2890564[2Glucuronicacid⁃3H2O⁃CO2]-异甘草皂苷E2b[12]4494853C42H62O17[M⁃H]-83739061677754061[M⁃H⁃H2O⁃CO2]-，6433512[M⁃H⁃Glucuronicacid⁃H2O]-，4853279[M⁃H⁃2Glucuronicacid]-，3510568[2Glucuronicacid⁃2H2O⁃H]-，2890563[2Glucuronicacid⁃3H2O⁃CO2]-甘草皂苷G2[12]4596358C42H62O17[M⁃H]-83739460847753910[M⁃H⁃H2O⁃CO2]-，6613613[M⁃H⁃Glucuronicacid]-，5993365[M⁃H⁃Glucuronicacid⁃CO2⁃H2O]-，4413322[M⁃H⁃2Glucuronicacid⁃CO2]-，3510557[2Glucuronicacid⁃2H2O⁃H]-，2890578[2Glucuronicacid⁃3H2O⁃CO2]-甘草皂苷G2异构体[12]4698388C42H62O16[M⁃H]-82140001587593895[M⁃H⁃H2O⁃CO2]-，6453643[M⁃H⁃Glucuronicacid]-，4693322[M⁃H⁃2Glucuronicacid]-，3510583[2Glucuronicacid⁃2H2O⁃H]-，2890551[2Glucuronicacid⁃3H2O⁃CO2]-甘草酸a

续表1

编号保留时间/min分子式离子类型测定分子量/(m/z)误差/ppm特征碎片离子化合物名称47100628C42H62O16[M⁃H]-82139903657593957[M⁃H⁃H2O⁃CO2]-，6453600[M⁃H⁃Glucuronicacid]-，4693332[M⁃H⁃2Glucuronicacid]-，3510552[2Glucuronicacid⁃2H2O⁃H]-，2890546[2Glucuronicacid⁃3H2O⁃CO2]-异甘草酸[12，16]48101188C42H62O16[M⁃H]-82140136456273541[M⁃H⁃Glucuronicacid⁃H2O]-，4253399[M⁃H⁃2Glucuronicacid⁃CO2]-，3510572[2Glucuronicacid⁃2H2O⁃H]-，2890605[2Glucuronicacid⁃3H2O⁃CO2]-甘草皂苷H2或K2[12]49101678C42H64O16[M⁃H]-82341304137614035[M⁃H⁃H2O⁃CO2]-，6473741[M⁃H⁃Glucuronicacid]-，4713493[M⁃H⁃2Glucuronicacid]-，3510551[2Glucuronicacid⁃2H2O⁃H]-，2890582[2Glucuronicacid⁃3H2O⁃CO2]-甘草皂苷J2异构体[12]50103673C17H26O4[M⁃H]-29317797162491827[M⁃H⁃C3H8]-，2371123[M⁃H⁃C4H9]-，2211567[M⁃H⁃C5H12]-6⁃姜酚b[17]51111537C30H46O4[M⁃H]-46933630644233264[M⁃H⁃CO2]-甘草次酸a

注：a.与对照品对照鉴定的化合物；b.桂枝汤中首次报道的化合物；pOHBA=4-羟基苯甲酸；Va=4-羟基-3-甲氧基-苯甲酸；BA=苯甲酸；GA=没食子酸

Note：a. chemical compound for contrasting and identification with control substance；b. chemical compound reported for the first time in Guizhi decoction；pOHBA=4-hydroxybenzoic acid；Va=4-hydroxy-3-methoxy- benzoic acid；BA=benzoic acid；GA=gallic acid

图3 氧化芍药苷亚硫酸酯可能的质谱裂解途径Fig 3 Possible MS cleavage pathway of paeoniflorin sulfuric acid ester

2.6.2 化合物3(tR=9.59 min)的结构分析：在负离子模式下，一级质谱图给出准分子离子峰m/z589.124 1([M-H]-)，预测分子式为C24H30O15S。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)421.084 4[M-H-Va]-、375.075 0[M-H-Va-HCOOH]-、259.029 7[M-H-Va-Glc]-和213.025 1[M-H-HCOOH-Va-Glc]-(Va=4-羟基-3-甲氧基-苯甲酸)。以上信息符合牡丹皮苷E亚硫酸酯的裂解规律，并与文献[11]报道数据基本一致。因此，推测3号峰为牡丹皮苷E亚硫酸酯。

2.6.3 化合物4(tR=11.20 min)的结构分析：在负离子模式下，一级质谱图给出准分子离子峰为m/z705.172 2([M-H]-)，预测分子式为C29H38O18S。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)583.132 2[M-H-BA]-、543.116 3[M-H-Glc]-、537.128 9[M-H-BA-HCOOH]-、497.128 9[M-H-Glc-HCOOH]-、421.080 0[M-H-BA-Glc]-、381.066 0[M-H-2Glc]-、259.027 1[M-H-BA-2Glc]-和213.024 1[M-H-BA-HCOOH-2Glc]-(BA=苯甲酸)。以上信息符合异麦芽糖芍药苷亚硫酸酯的裂解规律，并与文献[11]报道数据基本一致。因此，推测4号峰为异麦芽糖芍药苷亚硫酸酯。

2.6.4 化合物8(tR=15.30 min)的结构分析：在负离子模式下，一级质谱图给出m/z525.162 2([M+HCOO]-)，预测分子式为C24H30O13。提取该离子流图，发现与10、12、14和22号峰分子量相同。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)495.157 0[M-H-HCHO]-、363.104 5[M-H-Glc]-、329.084 4[Glc+BA-H]-、327.110 8[M-H-HCHO-BA]-和167.039 1[M-H-HCHO-BA-Glc]-。以上信息符合牡丹皮苷E的裂解规律，并与文献[11]报道数据基本一致。因此，推测8号峰为牡丹皮苷E。

2.6.5 化合物13(tR=26.42 min)的结构分析：在负离子模式下，一级质谱图给出m/z495.154 7([M-H]-)，预测分子式为C23H28O12。二级质谱产生碎片离子峰m/z465.145 4[M-H-HCHO]-。以上信息符合邻氧化芍药苷的裂解规律，并与文献[11]报道数据基本一致。因此，推测13号峰为邻氧化芍药苷。

2.6.6 化合物14(tR=32.90 min)的结构分析：在负离子模式下，一级质谱图给出m/z525.162 1([M+HCOO]-)，预测分子式为C23H28O11。提取该离子流图，发现与8、10、12和22号峰分子量相同。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)479.158 1[M-H]-、449.143 6[M-H-HCHO]-、357.121 9[M-H-BA]-、327.110 6[M-H-HCHO-BA]-、283.082 8[BA+Glc-H]-和195.059 1[M-H-BA-Glc]-。以上信息符合芍药内酯苷R1的裂解规律，并与文献[11]报道数据基本一致。因此，推测14号峰为芍药内酯苷R1。

2.6.7 化合物16(tR=34.20 min)的结构分析：在负离子模式下，一级质谱图给出m/z549.163 4([M-H]-)，预测分子式为C26H30O13。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)417.121 9[M-H-Apiosyl]-、297.073 2[Apiosyl+Glc-H]-和255.065 4[M-H-Apiosyl-Glc]-(Apiosyl=芹糖)。以上信息符合甘草苷元4′-O-芹糖-O-葡萄糖苷的裂解规律，并与文献[12]报道数据基本一致。因此，推测16号峰为甘草苷元4′-O-芹糖-O-葡萄糖苷。

2.6.8 化合物19(tR=45.68 min)的结构分析：在负离子模式下，一级质谱图给出m/z631.167 6([M-H]-)，预测分子式为C30H32O15。提取该离子，发现与17号峰有相同分子量。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)465.142 1[M-H-BA-CO2]-、313.056 7[GA+Glc-H-H2O]-(BA=苯甲酸，GA=没食子酸)。以上信息符合没食子酰芍药苷的裂解规律，并与文献[13-14]报道数据基本一致。因此，推测19号峰为没食子酰芍药苷。

2.6.9 化合物22(tR=48.44 min)的结构分析：在负离子模式下，一级质谱图给出m/z525.164 8([M+HCOO]-)，预测分子式为C23H28O11。提取该离子流图，发现与8、10、12和14号峰分子量相同。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)479.157 6[M-H]-、357.121 5[M-H-BA]-和283.080 6[BA+Glc-H2O-H]-(BA=苯甲酸)。以上信息符合异芍药苷的裂解规律，并与文献[11]报道数据基本一致。因此，推测22号峰为异芍药苷。

2.6.10 化合物23(tR=49.95 min)的结构分析：在正离子模式下，一级质谱图给出m/z149.025 2([M+H]+)，预测分子式为C9H8O3。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)121.030 1[M+H-CO]+、108.0497[M+H-CO]+和91.002 3[M+H-C2O-H2O]+。以上信息符合2-羟基桂皮醛的裂解规律，并与文献[15]报道数据基本一致。因此，推测23号峰为2-羟基桂皮醛。

2.6.11 化合物33(tR=76.34 min)的结构分析：在负离子模式下，一级质谱图给出821.402 7([M-H]-)，预测分子式为C42H62O16。提取该离子流图，发现与46、47和48号峰的分子质量相同。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)759.388 2[M-H-H2O-CO2]-、645.368 9[M-H-Glucuronic acid]-、351.054 4[2Glucuronic acid-2H2O-H]-和289.058 5[2Glucuronic acid-3H2O-CO2]-。以上信息符合甘草皂苷H2或K2的裂解规律，且与48号峰二级质谱相同，并与文献[12]报道数据基本一致。因此，推测33号峰为甘草皂苷H2或K2。

2.6.12 化合物36(tR=82.08 min)的结构分析：在负离子模式下，一级质谱图给出835.378 5([M-H]-)，预测分子式为C42H60O17。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)791.385 2[M-H-CO2]-、659.337 9[M-H-Glucuronic acid]-、351.056 4[2Glucuronic acid-2H2O-H]-和289.053 9[2Glucuronic acid-3H2O-CO2]-。以上信息符合23-羟基甘草皂苷E2的裂解规律(见图4)，并与文献[12]报道数据基本一致。因此，推测36号峰为23-羟基甘草皂苷E2。

2.6.13 化合物38(tR=82.92 min)的结构分析：在负离子模式下，一级质谱图给出879.407 6([M-H]-)，预测分子式为C44H64O18。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)643.345 5[M-H-Glucuronic acid-Acetoxyl]-、423.328 8[M-H-2Glucuronic acid-Acetoxyl-CO2]-、351.057 3[2Glucuronic acid-H-2H2O]-和289.056 6[2Glucuronic acid-H-3H2O-CO2]-。以上信息符合22β-乙酰基甘草酸的裂解规律，并与文献[12]报道数据基本一致。因此，推测38号峰为22β-乙酰基甘草酸。

2.6.14 化合物40(tR=91.18 min)的结构分析：在负离子模式下，一级质谱图给出837.391 2([M-H]-)，预测分子式为C42H62O17。提取该离子流图，发现与37、44和45号峰的分子质量相同。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)775.389 9[M-H-H2O-CO2]-、661.358 4[M-H-Glucuronic acid]-、485.328 7[M-H-2Glucuronic acid]-、351.057 5[2Glucuronic acid-2H2O-H]-和289.055 2[2Glucuronic acid-3H2O-CO2]-。以上信息符合甘草皂苷G2的裂解规律，且与37、44和46号峰二级质谱图基本一致，并与文献[12]报道数据基本一致。因此，推测40号峰为甘草皂苷G2异构体。

2.6.15 化合物41(tR=91.88 min)的结构分析：在负离子模式下，一级质谱图给出819.384 3([M-H]-)，预测分子式为C42H60O16。提取该离子流图，发现与43号峰的分子质量相同。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)757.378 6[M-H-H2O-CO2]-、643.353 2[M-H-Glucuronic acid]-、467.324 6[M-H-2Glucuronic acid]-、351.054 8[2Glucuronic acid-2H2O-H]-和289.056 8[2Glucuronic acid-3H2O-CO2-H]-。以上信息符合甘草皂苷E2的裂解规律，且与43号峰二级质谱图基本一致，并与文献[12，16]报道数据基本一致。因此，推测41号峰为甘草皂苷E2。

2.6.16 化合物43(tR=92.79 min)的结构分析：在负离子模式下，一级质谱图给出819.381 1([M-H]-)，预测分子式为C42H60O16。提取该离子流图，发现与41号峰的分子质量相同。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)643.338 6[M-H-Glucuronic acid]-、351.055 9[2Glucuronic acid-2H2O-H]-和289.056 4[2Glucuronic acid-3H2O-CO2]-。以上信息与41号峰二级质谱图基本一致，并与文献[12]报道数据基本一致。因此，推测43号峰为甘草皂苷E2异构体。

2.6.17 化合物50(tR=103.68 min)的结构分析：在负离子模式下，一级质谱图给出293.177 9([M-H]-)，预测分子式为C17H26O4。二级质谱图中可见碎片离子峰(m/z)249.182 7[M-H-C3H8]-、237.112 3[M-H-C4H9]-和221.156 7[M-H-C5H12]-。以上信息符合6-姜酚的裂解规律，并与文献[17]报道的数据基本一致。因此，推测50号峰为6-姜酚。

图4 23-羟基甘草皂苷E2可能的质谱裂解途径Fig 4 Possible MS cleavage pathway of 23-hydroxyglycyrrhizin E2

3 讨论

本研究采用HPLC-ESI-IT-TOF-MSn技术对桂枝汤中所含的化学成分进行分析，通过质谱中准分子离子峰和二级质谱中碎片离子峰的信息，结合文献数据及对照品质谱信息，指认了桂枝汤中51种化合物，其中通过对照品确认的化合物有20种、桂枝汤中首次报道的化合物有20种。

桂枝汤临床疗效确切，使用历史悠久，是中医著名方剂，其发挥治疗作用的物质基础在于其所含有的化学成分。虽然组成桂枝汤的桂枝、芍药和甘草等单味药的化学成分研究报道较多，但对作为中药复方的桂枝汤的化学成分研究少有报道。通过HPLC-ESI-IT-TOF-MSn技术快速准确地对桂枝汤中主要化学成分进行分析，丰富了桂枝汤中化学成分的信息，为明确桂枝汤的药效物质基础、探索桂枝汤的质量控制方法提供了依据。

[1]周硕，霍海如，郭建友，等.桂枝汤对体温整合调节作用的活性成分研究[J].中国中药杂志，2007，32(9)：865-867.

[2]Zhou S，Liang H，Cai S Q，et al.Studies on the chemical constituents of the active fraction of Gui-zhi decoction[J].J Chin Pharm Sci，2007，16(1)：24-26.

[3]曹进，戴德舜，王义明，等.桂枝汤A部分有效成分指纹图谱归属：二[J].中国实验方剂学杂志，2001，7(3)：1-4.

[4]陈璐琳.桂枝汤化学成分液相色谱-质谱分析及其抗炎活性研究[D].浙江：浙江大学药学院，2015.

[5]陈莹蓉，马越鸣，张宁.桂枝汤类方化学成分含量研究[J].中成药，2010，32(6)：996-1000.

[6]柏冬，范斌，牛晓红，等.多波长高效液相色谱法同时测定桂枝汤中5种有效成分的含量[J].药物分析杂志，2010，30(1)：1-5.

[7]毛泉明，张钰泉，叶福媛，等.桂枝汤多指标定量法[J].中国医院药学杂志，2006，26(2)：170-172.

[8]袁鹏飞，刘焕，尚明英，等.桂枝汤中9种主要成分含量的测定和不同煎煮方式的比较研究[J].中国药房，2016，27(6)：801-805.

[9]Yuan PF，Ma YJ，Su D，et al.Quantification of seven phenylpro-panoid compounds in Chinese Cinnamomi Cortex and Ramulus by HPLC[J].J Chin Pharm Sci，2015，24(9)：591-599.

[10] 袁鹏飞，尚明英，蔡少青.桂枝、肉桂化学成分指纹图谱研究[J].中国中药杂志，2012，37(19)：2917-2921.

[11] Li SL，Song JZ，Choi FF，et al.Chemical profiling of Radix Paeoniae evaluated by ultra-performance liquid chromatography/photo-diode-array/quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2009，49(2)：253-266.

[12] Ye M，Liu SH，Jiang Z，et al.Liquid chromatography/mass spectro-metry analysis of PHY906，a Chinese medicine formulation for can-cer therapy[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2007，21(22)：3593-3607.

[13] Chen L，Qi J，Chang YX，et al.Identification and determination of the major constituents in Traditional Chinese Medicinal formula Dang-gui-Shaoyao-San by HPLC-DAD-ESI-MS/MS[J].J Pharm Biomed Anal，2009，50(2)：127-137.

[14] Zhang W，Saif MW，Dutschman GE，et al.Identification of chemicals and their metabolites from PHY906，a Chinese medicine formulation，in the plasma of a patient treated with irinotecan and PHY906 using liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC/MS/MS)[J].J Chromatogr A，2010，1217(37)：5785-5793.

[15] Ding Y，Wu EQ，Liang C，et al.Discrimination of cinnamon bark and cinnamon twig samples sourced from various countries using HPLC-based fingerprint analysis[J].Food Chem，2011，127(2)：755-760.

[16] 周燕，王明奎，廖循，等.甘草化学成分的高效液相色谱-串联质谱分析[J].分析化学，2004，32(2)：174-178.

[17] Park SY，Jung MY，et al.UHPLC-ESI-MS/MS for the Quantification of Eight Major Gingerols and Shogaols in Ginger Products：Effects of Ionization Polarity and Mobile Phase Modifier on the Sensitivity[J].J Food Sci，2016，81(10)：C2457-C2465.