CIAPIN1对HepG2细胞增殖和细胞周期的影响

欧志涛，詹远京，郭家伟，罗 铎

细胞因子诱导的凋亡抑制分子1（cytokine-ind uced apoptosis inhibitor 1，CIAPIN1）是受体依赖性激酶Ras信号通路中的效应分子[1]。研究显示，CIAPIN1被敲除后，胚胎鼠发育个体小，循环和造血器官，如心脏、肝脏、脾脏等发育异常[2]。另有研究指出，CIAPIN1表达与肝癌组织学分级呈负相关，与TNM分级呈正相关[3]。上述发现均提示CIAPIN1在肝癌的发生及发展过程中可能起重要作用，但CIAPIN1对肝癌细胞增殖能力的影响研究尚不多见。本研究构建重组慢病毒CIAPIN1表达载体和CIAPIN1沉默载体，探讨了体外调控CIAPIN1基因表达对肝癌HepG2细胞增殖能力的影响，并初步分析了其作用机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器和细胞 重组慢病毒CIAPIN1表达载体、CIAPIN1 siRNA慢病毒载体、无关对照siRNA慢病毒载体，均委托上海博上生物技术有限公司合成；ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix、LipofectamineTM 2000、293FT细胞，均购自Invitrogen公司；DMED培养液、胎牛血清，均购自Gibco公司；Matrigel，购自BD公司；全长 CIAPIN1 cDNA克隆pOTB7-CIAPIN1，购自上海英为信生物科技有限公司；鼠抗人CIAPIN1单克隆抗体、山羊抗鼠IgG-HRP，均购自Santa Cruz公司；EDTA购自Sigma公司；抗CyclinD1、抗CDK4、抗CDK2、抗Cyclin E抗体，购自Santa Cruz公司；NF-кB染色试剂购自Thermo公司；IKKβ、磷酸化IKBα、p65和磷酸化抗p65和抗PARP抗体，购自Bioworld Technology；RT-PCR检测仪及其配套分析软件，购自ABI公司；680型全自动酶标仪购自Bio-Rad公司；台式离心机、37℃恒温摇床，均为国产仪器。肝癌细胞株HepG2细胞由我院感染病研究所提供。

1.2 感染用病毒的包装 取对数生长期293FT细胞，以0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞密度至6×108个/L，接种至10 cm培养皿，在37℃、5%CO2环境下培养24 h，至细胞达70%～80%融合后，加入ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix、Lipofectamine TM 2000及预先制备的重组慢病毒载体DNA，进行转染。48 h后，取病毒上清液，4℃下4000 g离心10 min，用0.45μm滤膜过滤，测定病毒滴度，分装，置于-80℃保存。

1.3 病毒感染 取HepG2细胞，按105个/孔接种至6孔板，室温培育8 h，分别加入CIAPIN1表达慢病毒、CIAPIN1 siRNA慢病毒、无关对照siRNA慢病毒感染或不转染，病毒感染复数与细胞数比例为10：1。随后，加入polybrene，调整其浓度至5 μg/ml，持续培养8 h，更换新鲜培养液，加入Blasticidin，调整其浓度至5 μg/ml，筛选培养2～3 w，获得稳定的转导细胞。为确保最终能够获得CIAPIN1基因高表达组、CIAPIN1基因低表达组，并与无关siRNA干扰组和空白对照组区分，采用RT-PCR法检测各组CIAPIN1 RNA水平，选择GAPDH基因为内参照。CIAPIN1引物序列：Forward 5’-CCA GTG GAG GCT CTG AAA GG-3’，Revers e 5’-GAC ACG CGG CCC TCA TT-3’，探针序列 ：5’-FAM-ATAAGCTTCAAGCGTTAA C-TAMRA-3’；GAPDH 引物序列：Forward 5’-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3’，Reverse 5’-CCAAATTCGTTGTCATACCAGGAA ATG-3’，探针序列：5’-FAM-CGA CAC CCA CTC CTC CAC CTT TGA CGC-TAMRA-3’。根据 Ct值确定对应基因的拷贝数，结果以CIAPIN1基因与内参照基因拷贝数比值表示。上述实验中每组设6孔，取均值。

1.4 细胞CIAPIN1蛋白表达量检测 采用免疫印迹法检测，收集各组细胞，超声破碎后测定蛋白含量，并取一定样品，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至PVDF膜，以5%脱脂奶粉在4℃条件下封闭6 h。随后，加入鼠抗人CIAPIN1抗体，在4℃条件下孵育过夜。再加山羊抗鼠IgG-HRP二抗，孵育1 h，以化学发光法检测CIAPIN1蛋白表达量。

1.5 细胞增殖检测 取对数生长期细胞，制备成4×104个/ml单细胞悬液，接种于96孔板，每孔200 μl，每组24孔，进一步将各组分为4个小组，37℃、5%CO2条件下培养，4个小组分别培养24 h、48 h、72 h、96 h，加 5 mg/ml MTT 20μg，继续培养 4 h，弃上清，加 DMSO 150 μl，震荡溶解，在酶标仪上测量490 nm波长下光密度值，以此结果绘制4组细胞生长曲线。

1.6 细胞周期测定 将同步化的各组细胞以PBS洗2次，加入预冷75%乙醇，4℃过夜固定后，弃乙醇，再次以PBS洗，加RNase 100 μg/ml，加碘化丙啶避光染色20 min，上流式细胞仪（FACS Calibur分析型，美国Bio-Rad公司）测定细胞周期。

1.7 其它相关蛋白检测 细胞周期相关蛋白分子包括 cyclinD1、CDK4、CDK2、cyclin E，NF-кB 信号通路相关分子、IKKβ、磷酸化IKBα、p65和磷酸化p65。均提取总蛋白后采用Western blotting法检测。1.8统计学方法 应用SPSS 19.0软件处理数据。CIAPIN1 mRNA及其蛋白的相对水平以（±s）表示，多组间数据的比较采用单因素方差分析及LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组细胞CIAPIN1 mRNA及其蛋白表达水平比较 CIAPIN高表达组CIAPIN1 mRNA及其蛋白表达水平较空白对照组或无关siRNA干扰组明显升高（P＜0.05）；CIAPIN低表达组CIAPIN1 mRNA及其蛋白表达水平较空白对照组或无关siRNA干扰组明显降低（P＜0.05）；空白对照组与无关siRNA干扰组IAPIN1 mRNA及其蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05，表1、图1）。

表1 四组细胞CIAPIN1 mRNA及蛋白表达水平（±s）比较

表1 四组细胞CIAPIN1 mRNA及蛋白表达水平（±s）比较

与CIAPIN1高表达组比，①P＜0.05；与CIAPIN1低表达组比，②P＜0.05

孔数CIAPIN1高表达CIAPIN1低表达无关siRNA干扰空白对照6 6 6 6 CIAPIN1 mRNA CIAPIN1蛋白0.811±0.038 0.728±0.028 0.093±0.031① 0.183±0.035①0.287±0.045①② 0.410±0.053①②0.292±0.035①② 0.408±0.051①②F 35.855 37.036 P 0.000 0.000

A：CIAPIN1 高表达组；B：CIAPIN1 低表达组；C：无关siRNA干扰组；D：空白对照组；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

图2 四组细胞增殖情况比较 CIAPIN1高表达组细胞生长旺盛，CIAPIN1低表达组细胞生长受到明显抑制

2.2 四组细胞增殖情况比较 CIAPIN高表达组、无关siRNA干扰组和空白对照组细胞均持续保持良好的生长趋势，而CIAPIN低表达组细胞生长受到明显抑制（图2）。

2.3 细胞周期变化情况 CIAPIN1高表达组S期和G2/M期细胞比例明显高于其他各组，G0/G1期细胞比例明显低于其它各组；CIAPIN1低表达组S期和G2/M期细胞比例明显低于其它各组，G0/G1期细胞比例明显高于其它各组（P＜0.05）；空白对照组与无关siRNA干扰组比，细胞周期差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表2 细胞周期（n=6，±s）比较

表2 细胞周期（n=6，±s）比较

与CIAPIN1高表达组比，①P＜0.05；与CIAPIN1低表达组比，②P＜0.05

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2.4 四组细胞周期蛋白水平比较 CIAPIN1高表达组 cyclinD1、CDK4、CDK2、cyclinE 表达明显强于其它各组；CIAPIN1低表达组上述蛋白的表达明显低于其它各组，差异均有统计学意义（P＜0.05，图3）。

图3 四组细胞周期蛋白水平比较

2.5四组NF-кB信号通路相关分子的表达情况 CIAPIN1高表达组磷酸化IKBα和磷酸化p65表达高于其它各组，CIAPIN1低表达组上述指标低于其它各组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；CIAPIN1低表达组p65水平明显高于其它各组，差异有统计学意义（P＜0.05，表3）。

表3 四组NF-кB信号通路相关分子（n=6，±s）表达情况

表3 四组NF-кB信号通路相关分子（n=6，±s）表达情况

与CIAPIN1高表达组比，①P＜0.05；与CIAPIN1低表达组比，②P＜0.05

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3 讨论

CIAPIN1蛋白在胚胎和成人组织中广泛存在[4-8]。在胎儿的早期血管细胞、干细胞、骨骼肌细胞等影响生长发育的细胞中表达极高，提示其对促进细胞生长发育有重要作用[9]；在成人，除上述组织外，胰岛细胞、皮肤角质层细胞、睾丸间质细胞中也能检出其高表达，提示其对维持细胞增殖有重要作用。

目前已有研究探讨了CIAPIN1基因及其蛋白对多种肿瘤细胞的影响，但得出的结论并不完全一致。如杨静等认为CIAPIN1基因在结肠癌组织低表达，可能与结肠癌的发生及发展有关，并指出抑制该基因的表达可能是靶向性治疗结肠癌的新方向。研究发现下调CIAPIN1 mRNA有助于抑制慢性髓系白血病细胞系K562细胞的增殖能力，说明CIAPIN1 mRNA高水平可能与K562细胞的增殖有关。肝癌组织CIAPIN1 mRNA水平越高，肿瘤分化程度越低，TNM分期越高，提示其高表达与肿瘤恶化有关[3]。

本研究重点探讨了CIAPIN1对HepG2增殖的影响，结果显示其能促进肿瘤细胞增殖，细胞在G1/S期明显缩短，而下调其表达，肿瘤细胞增殖能力明显受抑制，细胞被阻滞在G1/S期，说明其对肝癌细胞的生物学影响是促进其增殖能力。

本研究观察到CIAPIN1过表达组细胞周期相关蛋白 cyclinD1、CDK4、CDK2、cyclinE 均明显上升，且磷酸化IKBα、磷酸化p65表达也明显上升，提示CIAPIN1蛋白主要通过上调细胞周期蛋白、激活NF-кB通路等途径影响肝癌细胞的增殖。已有多项研究证实NF-кB信号通路直接参与了肝癌的发生发展，干扰NF-кB信号通路活化能够通过促细胞凋亡和改变细胞周期机制，抑制肝癌细胞的增殖。另有研究认为CIAPIN1基因还与肿瘤的血管形成和肿瘤多药耐药性形成等有明显的相关性。

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