肉苁蓉多糖对更年期高血压燥证大鼠内分泌 功能调节的研究

张娜娜

(开封市中医院药学部，河南 开封 475001)

更年期高血压是由于机体内分泌代谢紊乱并伴有植物神经功能失调从而引发的血压波动，有近80%的女性会出现该症状，并且该阶段血压波动易受到情绪、睡眠等外界因素的干扰，导致血压变异性较大，常规降压药控制不理想，并且长期服用有不同程度的不良反应发生。现代研究更年期血压异常波动可能与患者内分泌激素水平变化有明显关联[1]，临床治疗主要以雌激素替代疗法进行干预，而该方法不适用于有激素禁忌症的患者，如肝肾功能障碍、乳腺癌、糖尿病等，与此同时也会增加患者心脑血管疾病及生殖系统副反应发生的几率[2]；相对于祖国医学对该疾病的治疗，则显的更具有优势，中医药辨证组方不但能对血压进行不同幅度的调节，还能改善患者睡眠状况、减轻患者临床症状，临床治疗以疗效确切、毒副作用少等优点而受到患者的好评。肉苁蓉为列当科寄生植物，是“药食两用”之品，营养价值高，具有独特的医药和保健功能，其中多糖(cistanche deserticola polysaccharides,CDPS)为其主要生物学活性组分，有研究显示由肉苁蓉组方制成的制剂能改善更年期综合征的临床症状[3]，且肉苁蓉对雌性肾虚小鼠有促卵泡发育、促黄体生成作用，显示了肉苁蓉对雌性肾虚小鼠内分泌功能的调节作用[4]，但对于肉苁蓉多糖的调节作用机制尚未有深入研究，基于此，本研究以更年期妇女患者的临床指征为基础复制更年期高血压燥证动物模型，并给予肉苁蓉多糖进行干预治疗，以考察肉苁蓉多糖对更年期患者内分泌系统的调节机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康雌性SPF级SHR大鼠65只，体质量(200.0±15.0)g，购自河南省实验动物中心，许可证号SCXK(豫)2014-0009。大鼠喂养普通饲料，自由饮水，避免噪声及其他环境因素干扰。

1.2 试药与试剂

肉苁蓉饮片500 g(购自张仲景大药房,产地：内蒙古，批号20121025)；其他试剂均为分析纯。坤泰胶囊(贵阳新天药业股份有限公司，批号140507)；内分泌指标[雌二醇(estradiol,E2)、促卵泡生成激素(follicle stimulating hormone,FSH)、促黄体酮生成激素(luteinizing hormone,LH)] Elisa检测试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；神经递质[去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、神经肽Y(neuropettide Y,NPY)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)] Elisa检测试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司。

1.3 仪器与设备

超声波清洗器(KQ-300VDV，昆山市超声仪器有限公司)；岛津2010型紫外可见分光光度计(日本)；ACCESS型全自动化学发光免疫分析仪(美国BECKMAN COULTER公司)；AB204-S型梅特勒电子天平(北京梅特勒-托利多有限公司)；动物无创血压测量仪(BP-100A型，程度泰盟科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 肉苁蓉多糖的制备

取肉苁蓉饮片500 g，加10倍量水浸泡30 min，加热提取2次，每次1.5 h，合并煎液(呈棕红色)，浓缩至2∶1(体积质量比)，离心(3 000 r/min)15 min，取上清液，加入3倍量95%乙醇沉淀，冷藏并静置24 h，离心分离沉淀，将沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，将洗涤后的沉淀真空干燥，采用蒽酮-硫酸法测定肉苁蓉多糖的含量，即得到肉苁蓉多糖粗品(灰棕红色，得率为10.13%)。

1.4.2 分组与给药

所有大鼠购回后分笼饲养，适应1周后分组，剔除体质量偏差较大的SHR大鼠3只，其余62只按照随机数字表法分为5组，分别为SHR组，假手术组，模型组(更年期高血压燥证模型)，阳性组(坤泰胶囊，1.08 g/kg)，肉苁蓉高剂量组(相当于肉苁蓉生药量11.84 g，1.2 g/kg)、低剂量组(相当于肉苁蓉生药量5.92 g，0.6 g/kg)；按照《药理实验中动物间和动物与人间的等效剂量换算》公式换算大鼠给药剂量，2015版《中国药典》肉苁蓉用量为6～10 g/d，肉苁蓉多糖粗品1 g相当于肉苁蓉生药量9.87 g，给药前取肉苁蓉多糖适量于灭菌生理盐水中，配制成0.1 g/mL的肉苁蓉多糖溶液，阳性组取内容物配制成浓度为0.1 g/mL的水溶液，按照体质量计算每次给药剂量，正常对照组和模型组给予等剂量的生理盐水。除肉苁蓉多糖两个剂量组分别11只大鼠外，其余三组均为10只。各组动物连续给药4周，观察并记录药物干预期间动物行为学特征变化。

1.4.3 动物模型的复制

方法复制更年期高血压燥证大鼠模型[5-6]，采用手术方法摘除双侧卵巢，复制更年期高血压大鼠，在模型复制成功1周后，每日给予特殊饲料(饲料配方：普通大鼠饲料+0.5%孜然+0.5%五香粉+10%动物脂肪+2.5%油炸花生仁+2.5%熟芝麻)100 g，饮用水200 mL，保持饲养笼温度和相对湿度恒定，连续造模3周，复制更年期高血压燥证大鼠，模型复制期间密切观察动物生物学特性并及时记录。

1.4.4 指标的检测

实验结束后，采用动物无创血压测量仪检测实验前后大鼠尾动脉收缩压(测量3次，取平均值)。10%水合氯醛溶液腹腔麻醉(35 mg/kg)，腹主动脉取血约5 mL，以3 000 r/min速度离心15 min，分离血清于Eppendorf管，-20 ℃冷冻保存待测。采用放免法测定血清内分泌指标(E2、FSH、LH)。取血后的大鼠迅速断头取脑，采用化学荧光法测定下丘脑神经递质(5-HT、NE、DA、NPY、5-HIAA)含量。

1.4.5 统计学处理

采用SPSS17.0数据处理系统对实验数据进行统计学分析，首先对实验数据进行正态性检验(KS检验)，符合正态分布且方差齐的数据采用单因素方差分析法进行多组间比较；不符合正态分布的数据采用Chi-square检验，所有统计比较以P<0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 更年期高血压燥证大鼠模型评价

更年期高血压燥证模型大鼠表现出明显的好斗、易怒、性情急躁等特点，动物饮食量降低，毛发槁枯，该症状与临床特征相一致。

2.2 各组大鼠在药物干预前后血压水平变化

表1 摘除卵巢前后各组大鼠尾动脉收缩压变化

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与阳性组比较，cP<0.05

由表1可以看出：假手术组与SHR组相比血压变化不明显，差异没有统计学意义(P>0.05)；模型组大鼠血压较SHR组有明显上升，与假手术组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3 各组大鼠在药物干预前后血清内分泌水平变化

由表2可以看出：与假手术组和SHR组大鼠相比模型组大鼠内分泌激素水平较大，组间差异明显(P<0.05)，集中体现在E2水平大幅度下降，FSH、LH表达水平明显上升，提示模型组大鼠内分泌指标出现紊乱，符合更年期高血压临床特征。给予药物干预后，阳性组和CDPS高、低剂量组大鼠的内分泌水平有不同程度的改善，其中阳性组改善作用更为明显，CDPS高、低剂量组对E2水平的改善程度稍弱，与模型组相比，差异没有统计学意义(P>0.05)，而对FSH、LH指标改善明显，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠血清内分泌指标水平比较

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与阳性组比较，cP<0.05

2.4 各组大鼠在药物干预前后各血清神经递质含量变化

由表3可以看出：模型组大鼠与假手术组相比，各神经递质表达水平有显著差异(P<0.05)，提示模型组大鼠神经递质表达水平异常，该症状符合更年期高血压燥证临床特征。经药物干预治疗后，与模型组相比，除CDPS低剂量组对DA调节作用稍弱以外(P>0.05)，阳性组和CDPS各剂量组均能不同程度的调整各神经递质的表达水平，且差异具有统计学意义(P<0.05)，其中阳性组作用强度较CDPS高剂量组强。

表3 各组大鼠血清神经递质指标水平变化

注：与模型组比较，aP<0.05；与阳性组比较，bP<0.05

3 讨论

更年期综合征(menopausal syndrome,MPS)是指更年期妇女由于卵巢功能衰退，E2分泌减少，机体对下丘脑-垂体系统的负反馈调节作用减弱，诱导下丘脑弓状核和室旁核脉冲式分泌促性腺激素释放激素(GnRH)至门脉循环系统，刺激垂体分泌FSH、LH增加，引起下丘脑-垂体-卵巢轴(hypothalamo-pituitary-ovarian axix,HPOA)功能紊乱[7]，进而影响下丘脑单胺类神经递质的平衡。神经递质在神经细胞间及神经细胞与内分泌、免疫系统之间信息传递有非常重要的作用，其中神经递质中以单胺类神经递质为主，包括儿茶酚胺类(如DA)、吲哚类(如5-HT)，而5-HT是控制人类情绪变化的最主要物质，直接影响机体的生理及心理功能，更年期妇女神经递质的异常变化会导致机体植物神经功能的异常，进而影响个人情绪与正常的生理功能，产生诸如失眠多梦、烦躁不安等症状[8]；有研究证实[9]血清E2表达水平的降低与FSH、LH的升高与女性更年期发病有明显关系。传统中医学中，对于更年期并与明确的名称与之相对应，根据患者临床症状，可将本病与“脏燥”“盗汗”“眩晕”等疾病相关联。祖国医学认为，女子以肝为先天，以血为用，更年期妇女天癸将绝而未绝，阴血亏虚，肝失所养，疏泄不力而致肝气郁结不畅，故“肝郁”为更年期发生之标；肝失条达，则气机不畅，血行不利，可成血瘀之弊，故“血瘀”为其主要病理表现；肝失所养，日久累肾，肾气日衰，精血不足，阴阳失衡，故而“肾虚”为发生之本；根据辨证，兼以祛痰、解郁、泻火之法；“更年期”实为本虚标实、虚实夹杂之证，治则当以“滋补肝肾”为主[10]，基于此，实验复制动物模型时在更年期高血压模型的基础上复制了燥证模型更符合更年期特征。

肉苁蓉属于《神农本草经》“上品”类中药，为列当科植物肉苁蓉(CistanchedeserticolaY .C.Ma)的干燥带鳞叶的肉质茎，具有补肾壮阳、添精补髓、养血润燥、悦色延年之功效，由于其资源的匮乏，目前已列为国家二级保护植物。现代药理学研究证实，肉苁蓉有多种生物学活性，发挥该生物学活性的主要活性成分为多糖类成分，如促进机体产生白介素-2、促进免疫细胞增殖、促进网状内皮系统吞噬、促进胸腺成熟细胞向外周释放等免疫调节作用[11-13]。坤泰胶囊(原名更年宁心胶囊)用于更年期综合征，尤其是对绝经过渡期更年期患者更为适合，提示该制剂可直接作用于卵巢组织，促进卵巢内微循环，增强卵巢供血功能，有效改善卵巢功能；同时组方中熟地黄、阿胶等中药能刺激已经闭锁的卵泡，恢复卵巢分泌激素的功能，调节激素分泌平衡；延长卵巢生命力，推迟女性绝经期[14-15]，因此本文以坤泰胶囊作为阳性药物参与对照。

从研究结果来看：卵巢摘除前后模型组大鼠尾动脉收缩压无明显变化(P>0.05)，提示摘除卵巢对SHR大鼠的应激性刺激尚未影响到血压的波动；摘除后的大鼠内分泌指标有异常变化，大鼠在被切除卵巢后，血清中雌激素E2表达水平显著下降(P<0.05)，提示此时下丘脑-垂体的负反馈作用减弱，代偿性使FSH、LH含量上升(P<0.05)，导致内分泌功能出现紊乱，该变化符合更年期特征，而内分泌的紊乱会影响到下丘脑单胺类神经递质的平衡；研究显示，CDPS高、低剂量组明显下调FSH、LH表达水平(P<0.05)，但对E2表达水平调整作用不明显，比模型组稍高，组间比较显示差异没有统计学意义(P>0.05)。从神经递质的角度来看：模型组大鼠血清5-HT、5-HIAA含量显著上升，NPY、NE、DA含量明显下降，该变化符合更年期妇女神经递质的变化情况；其主要原因可能是儿茶酚胺类递质合成代谢受到抑制，而分解代谢有所增强，同时会导致大脑内5-HT的代谢及神经活性相应增强，打破了5-HT/NE的动态平衡，而5-HT在机体中以抑制兴奋为主要效应，其指标的异常升高，会引起情绪低沉、抑郁寡欢，这也是5-HT能够引起神经功能低下导致抑郁症的病理生理基础之一。

综上所述，肉苁蓉多糖能通过增强HPOA功能实现肾上腺素与皮质激素的调节，FSH、LH指标的下调和E2含量的回升提示肉苁蓉多糖能显著改善机体的内分泌调节机制，纠正下丘脑神经递质紊乱状态，改善植物神经功能，稳定机体内环境，促进内分泌功能的改善，并加速新陈代谢，发挥改善更年期症状的作用。

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