基于“痛泻要方”探讨防风对TNBS 诱导大鼠UC 结肠TLR-4及外周血中TNF-α、IL-1β的影响

郭军雄，马丽，汪斌，闫立国

(1.河西学院医学院，甘肃 张掖 734000；2.河西学院中西医结合研究所，甘肃 张掖 734000)

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)作为一种常见的非特异性肠道炎症性疾病，其病因和发病机制尚不明确，目前研究认为UC的发病主要由免疫反应介导并与遗传和环境因素密切相关[1]。大部分UC可伴终身，严重威肋到患者的生活质量，且有一定的癌变风险，迄今尚无特效的治疗方法，已被世界卫生组织列为现代难治病之一。中医治疗 UC优势明显，其组方中大多注重风药的应用，但治疗机制不明。前期研究表明[2],“痛泻要方”配伍风药具有减轻UC模型大鼠结肠组织炎性反应，减缓黏膜充血水肿来促进实验性UC大鼠溃疡愈合的作用。本课题组拟在前期研究基础上，观察防风、痛泻要方、痛泻要方祛防风对UC大鼠结肠黏膜TOLL 样受体4(TLR-4)，血清白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

健康SPF级Wistar大鼠72只，雌雄各半，体质量(180±20)g，由甘肃中医药大学科研实验中心提供。动物合格证号：SCXK(甘)2011-0001；动物设施合格证号：SYXK(甘)2011-0001。

1.2 实验药品、试剂

痛泻要方制备：依据《景岳全书·卷五十四》中痛泻要方药物组成及剂量的比例确定。药材由河西学院第二附属医院药房提供，将上述药物洗净，浸泡40 min，加水煎煮两次，合并煎液，过滤，95℃水浴浓缩至每毫升含生药0.75 g。同样的方法制备痛泻要方去防风和防风水煎剂，药物最终浓度相当每毫升含生药0.75 g。以上药物制成后，分装，高压灭菌消毒，4℃冰箱保存备用。

SASP溶液：选取上海信谊天平药业有限公司生产的柳氮磺胺吡啶肠溶片(批号：09140806)；规格：0.25 g/片，用研钵研碎，调配至0.03 g/mL浓度的混悬液备用。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，批号：2008-16-2，sigma公司，由北京邦定泰克生物技术有限公司提供；无水乙醇，批号:20140501，天津市化学试剂工厂提供；肿瘤坏死因子(TNF-α)放射免疫试剂盒，批号：20151101；白介素-6(IL-6)放射免疫药盒，批号：20151015；白介素-1β(IL-1β)放射免疫药盒，批号：20151101，以上测试盒均购自北京华英生物技术研究所；大鼠抗COX-2免疫组化试剂盒，批号：AE062452；大鼠抗TLR4免疫组化试剂盒，批号：AE080653,以上测试盒均购自北京博奥森生物技术有限公司；SP-9001生物素标记山羊抗兔IgG免疫组化检测试剂盒，批号：15121A01；浓缩型DNA试剂盒，批号：K146712F，以上测试盒均购自北京中杉金桥公司。

1.3 主要仪器

TGL-16G离心机，上海安亭科学仪器厂；XK96-A快速混匀器，北京维欣仪奥科技发展有限公司；GB11240-89 GSY电热恒温水浴锅，北京市医疗设备厂；r-911全自动放免计数仪，中国科技大学实业总公司；BI-2000型医学图像分析系统,成都泰盟科技有限公司；MiE图像处理系统，山东易创电子有限公司；日本OLYMPUS-CX21型显微镜。

2 实验方法

2.1 动物分组造模

将72只大鼠根据体质量随机分为空白对照组、模型组、防风组、痛泻要方祛防风组、痛泻要方组、SASP组，每组12只，雌雄各半。各组大鼠正常饲养1周后，除空白对照组外，其余各组采用TNBS/乙醇溶液灌肠结合束缚和饮食失节法复制肝郁脾虚型UC模型：造模组大鼠每日不定时束缚四肢，限制其自由活动，每日4 h左右，隔日进食。束缚1周后，禁食(不禁水)24 h后用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 mL/100 g)，一次性将TNBS/乙醇液(100 mg/kgTNBS和50%乙醇0.25 mL)溶液，用直径2 mm聚丙烯管缓慢推入距肛门约7～8 cm深的结肠处，再注入约0.4 mL空气，提取大鼠尾巴保持倒立1 min后，平躺至麻醉清醒后正常喂养。空白组大鼠肛门内约8 cm处按照上述方法给予等体积生理盐水灌肠。

2.2 给药及取材

等效剂量以成人痛泻要方常规剂量的10倍计算，各组于造模成功后第2 d开始灌胃，痛泻要方组、痛泻要方祛防风组按生药7.5 g/kg剂量灌胃。空白对照组与模型组每日给予等体积生理盐水，SASP组按0.3 g/kg剂量灌胃，1次/d，连续21 d后取材。各组大鼠禁食不禁水24 h后，乙醚麻醉后于股动脉采血5 mL，37℃水中放置30 min，以3 000 r/min离心10 min，分离血清4℃冰箱保存，待测血清IL-1β、TNF-α。采血后脱颈处死大鼠，快速剖取病变结肠5～8 cm，肉眼观察结肠损伤并评分，部分结肠组织以4%多聚甲醛固定，用于免疫组化法检测TLR4蛋白表达。

2.3 检测指标

血清IL-1β、TNF-α由北京华英生物技术研究所检测；结肠黏膜TLR4采用免疫组化(SP法)，严格按试剂盒说明书操作。

2.4 TLR4蛋白表达结果及测量方法

TLR4蛋白表达以核膜或胞浆内有棕黄色颗粒为阳性，阳性染色细胞小于或等于10%定为阴性(-)，10%～30%为弱阳性(+)，30%～50%为阳性(++)，大于50%为强阳性(+++)。并采用BI-2000型医学图像免疫组化分析系统，随机选取5个视野，测量阳性细胞平均积分吸光度，吸光度越大蛋白表达强，反之则表达弱。

2.5 统计方法

3 结果

3.1 实验大鼠一般状态观察

实验大鼠经TNBS/乙醇溶液灌肠当天开始出现稀便，活动逐渐减少，肛周污浊，毛色发黄无泽且被粪便沾染，部分大鼠肉眼可见血便，伴有拖尾、易撕咬、喜扎堆等。防风和痛泻要方祛防风组大鼠症状改善缓慢，毛色仍显晦暗无泽，扎堆、稀便及血便缓解不明显；痛泻要方和SASP组大鼠症状改善明显，肛周干净，毛色光亮，粪便呈灰褐色颗粒状，基本同空白对照组。

3.2 各组UC大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的比较

模型组大鼠血清TNF-α水平显著高于空白对照组(P<0.01)；防风组、痛泻要方祛防风组、痛泻要方组和SASP组TNF-α含量均低于模型组，其中痛泻要方组和SASP组有显著差异(P<0.05)。

表1 各组UC大鼠血清TNF-α含量的比较

注：与空白对照组相比,▲▲P<0.01，▲P<0.05；与模型组比较,ΔP<0.05

3.3 各组UC大鼠血清白细胞介素1β(IL-1β)含量的比较

模型组大鼠血清IL-1β水平显著高于空白对照组(P<0.01)；防风组、痛泻要方祛防风组、痛泻要方组和SASP组IL-1β含量均低于模型组，尤以痛泻要方组和SASP组最为显著(P<0.01)。

表2 各组UC大鼠血清IL-1β含量的比较

注：与空白对照组相比,▲▲P<0.01，▲P<0.05；与模型组比较,ΔΔP<0.01

3.4 各组大鼠结肠组织TLR4蛋白免疫组化结果

TLR4蛋白表达于大鼠结肠黏膜及黏膜下层，空白对照组TLR4呈阴性(见图1)；模型组TLR4呈强阳性(见图2)；防风组TLR4呈阳性(见图3)；痛泻要方去防风组TLR4呈阳性(见图4)；痛泻要方组TLR4呈弱阳性(见图5)；SASP组TLR4呈弱阳性或阴性(见图6)。

图1 空白对照组结肠(×40)

图2 模型组结肠(×40)

图3 防风组结肠(×40)

图4 痛泻要方去防风组 结肠(×40)

图5 痛泻要方组结肠(×40)

图6 SASP组结肠(×40)

3.5 各组大鼠结肠黏膜TLR4蛋白阳性细胞平均积分光密度比较

模型组大鼠结肠黏膜TLR4蛋白表达阳性细胞平均积分光密度高于空白对照组；防风组、痛泻要方祛防风组、痛泻要方组和SASP组结肠黏膜TLR4蛋白表达阳性细胞平均积分光密度均低于模型组，尤以痛泻要方组和SASP组最为显著(P<0.05)。

表3 各组大鼠结肠黏膜TLR4蛋白表达阳性细胞平均积分光密度值

注：与空白对照组相比,▲▲P<0.01，▲P<0.05；与模型组比较,ΔΔP<0.01，ΔP<0.05

4 讨论

现代医学研究认为UC是一种与免疫直接相关的肠道疾病，主要由免疫反应介导并和遗传、环境因素密切相关。TOLL样受体4(toll-1ike receptor 4，TLR4)是介导天然免疫的重要的跨膜蛋白受体，与宿主细胞对各种微生物致病原的识别有关。TLR4能特异性识别并结合病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，经激活其下游MyD88依赖性及非依赖性信号传导分子，诱导核因子-κB(NF-κB)，转录因子AP-1激活，致使效应细胞分泌IL-1，IL-6，IL-8，TNF-α及IFN-γ等细胞因子，介导肠黏膜的免疫反应[3-4]。同时，IL-1、TNF-α和IFN-γ等又可促使肠上皮细胞的TLR4和其辅助蛋白MD-2的表达增加，进而触发和加重溃疡性结肠炎的发病[5]。故抑制NF-κB信号通路上游TLR4的表达可致下游NF-κB所介导的TNF-α，IL-1β等炎症因子表达和最终合成分泌的减少。有研究证实[6]，TLR4在正常的结肠黏膜中呈微量表达,而在UC的结肠黏膜中则呈现异常的高表达。TNF-α是按特定空间排布的3个单体堆叠成的三聚体，是目前已知的与UC发病关系最为密切的细胞因子之一。主要是由受到抗原刺激的单核—巨噬细胞和T淋巴细胞分泌产生，具有广泛生物学活性。TNF-α能通过参与激活中性粒细胞和上调血管内皮细胞黏附分子、促进肉芽肿的形成。同时还能加强单核巨噬细胞的吞噬功能，刺激IL-8,IL-1等细胞因子合成与释放，产生细胞因子的瀑布效应，促进炎症反应的扩大[7]。IL-1β是一种主要由单核—巨噬细胞分泌的多肽类细胞因子，可激活T淋巴细胞和B淋巴细胞，促进IL-2受体表达以及中性粒细胞浸润而上调免疫功能。更为主要的是IL-1β促使中性粒细胞和巨噬细胞活化及脱颗粒,促进炎性细胞释放前列腺素、血栓素、血小板活化因子等,增加上皮细胞和内皮细胞的通透性而炎症活性作用。另外，IL-1β还可通过诱导释放H2O2，影响Ca2+的释放，导致UC患者结肠平滑肌收缩功能紊乱而发生腹泻等症状[8]。

本研究将中医学的诊疗特点辨证论治列入假设范畴，故在采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌肠法基础上，加入束缚刺激合并饮食失节复合刺激法复制肝郁脾虚型UC大鼠。本研究结果显示：TNBS诱导大鼠UC结肠黏膜TLR4表达及血清TNF-α、IL-1β含量明显增加。运用中医经典名方进行干预治疗，痛泻要方是临床治疗肝旺脾虚所致腹泻的代表方剂，方中白术苦甘而温，补脾燥湿以治土虚，为君药；白芍酸寒，养血柔肝，缓急止痛，为臣药；陈皮辛苦温，理气醒脾和胃，为佐药；配伍少量“风药”防风，专入肝脾二经，辛散肝郁，甘舒脾气，且风药其性轻灵香燥，引导药物到达病变部位，发挥胜湿而止泻之功，故兼俱佐使之用。临床治疗UC，配伍防风和去掉防风疗效大不相同。本研究发现：痛泻要方全方明显减弱大鼠UC结肠黏膜TLR4蛋白表达，减低大鼠血清TNF-α、IL-1β的浓度。因此，我们推测痛泻要方治疗UC的可能机制是通过抑制NF-κB信号通路上游TLR4的表达，介导了下游TNF-α，IL-1β等炎症因子表达和最终合成分泌的减少，达到纠正了机体的异常免疫。本研究也从在一定程度上说明痛泻要方全方对UC大鼠的治疗作用明显优于缺防风方，证实了防风在痛泻要方中发挥着不可替代的佐助作用。

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