覆盆子对酒精戒断大鼠海马 中去甲肾上腺素的作用

邢宇双 ，吴宜艳* ，梁启超 ，杨志，赵容杰，Young Seob Gwak

(1.牡丹江医学院药学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.牡丹江医学院第二附属医院， 黑龙江 牡丹江 157011；3.大邱医科大学中医学院，韩国 大邱 706-828)

近年来，人们生活方式不断改善，社会节奏加快，经济压力和人际关系等问题日益突出，酗酒者人数也随之增加，目前在世界范围内，酒精依赖不仅严重损害个人身心健康、也是家庭暴力和犯罪的重要根源。随着我国生活水平的不断改善，饮酒成瘾者也逐年增多，数据表明，我国酒精的生产与消耗量呈逐年递增的趋势，而流行病学研究也显示酒精滥用和依赖问题日益增多[1-2]。酒精戒断焦虑症是酒精戒断情感障碍的主要表现，是导致酒精依赖者停用酒精后又重新强迫性觅酒的重要诱因之一[3]。酒精戒断焦虑症在酒精依赖的重要地位不仅表现在它是大多数酒精中毒患者的主要精神主诉，还通过目前主要用于治疗酒精依赖的有效药，苯二氮类是抗焦虑药的事实所支持。因此，通过阻断酒精戒断焦虑症而消除酒精依赖是非常有效而可行的治疗手段[4-5]。

乙醇是一种中枢神经抑制剂，它可同时影响很多中枢系统，酒精成瘾是一个通过犒赏机制反复强化的过程，中脑边缘多巴胺系统在这一过程中起到重要作用，另外内源性阿片系统紊乱和中枢稿赏系统失衡是造成酒精成瘾的重要原因[6]。机体内源性阿片肽通过受体多种信号传导系统调节细胞内各种代谢过程，从而维持生理稳态。大量研究证实，焦虑症与中枢神经递质去甲肾上腺素(NE)和五羟色胺(5-HT)功能障碍有关[7]。其中NE广泛作用于不同的脑区，调控觉醒和应激反应，其主要功能是通过对外界环境刺激作出反射，控制觉醒状态。NE系统功能失调可导致焦虑的发生。有研究证实，NE浓度升高可引起焦虑不安，容易烦躁和激怒，还可引起睡眠障碍、食欲下降、眩晕、心悸等症[8]。

覆盆子为蔷薇科悬钩子属植物，具有补肾固精、助阳等功效。大量研究表明覆盆子果实中富含鞣花酸、多糖、花青素、超氧化物、多酚类、黄酮、超氧化物歧酶等[9-10]，具有抗衰老、治疗泌尿道感染、减肥、抗癌防癌、保护心脏、抗氧化、降血脂、降血糖、防止心血管疾病等药理作用[11-17]，但针对覆盆子的抗焦虑作用却鲜有报道。本实验研究覆盆子提取物对酒精戒断大鼠焦虑征的作用，并探讨其作用机制，为覆盆子的功能开发提供依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(220～250 g)：由牡丹江医学院动物室提供。

1.2 实验试剂

覆盆子：购于牡丹江天利医药(经生药学鉴定为蔷薇科悬钩子属植物华东覆盆子的果实)；无水乙醇：哈尔滨市新达化工厂批号140720分析纯；氯化钠注射液(0.9%)：哈尔滨三联药业有限公司,批号140409F3；磷酸二氢钾：天津博迪化工股份有限公司,批号140606分析纯；去甲肾上腺素盐酸盐：上海基实药业有限公司,批号20140513；甲醇：天津市永大化学试剂有限公司,批号20150104,色谱纯；高氯酸：哈尔滨试剂化工厂,批号20141201,分析纯。

1.3 实验仪器

高效液相色谱仪LC2103：上海天美科学仪器有限公司Kromasil 100-5C18(250 mm×4.6 mm)；离心机：eppendorf centrifuge 5424；匀浆机：motor cordless749540-0000；高架十字迷宫：上海欣软信息科技有限公司。

2 实验方法

2.1 覆盆子提取物的制备

取干燥的中药覆盆子500 g磨成细粉，于乙醇中回流提取，过滤，减压蒸发，冻干。提取物根据冻干粉的干重估计，产率为10.6%。

2.2 建立酒精成瘾模型

选取健康SD(Sprague-Dawley)大鼠35只，体质量220～250 g，随机分为空白组(生理盐水)，模型组(20%Eth)，覆盆子高剂量组(20%Eth+覆盆子提取物180 mg/kg)，覆盆子中剂量组(20%Eth+覆盆子提取物120 mg/kg)，覆盆子低剂量组(20%Eth+覆盆子提取物60 mg/kg)，阳性药物组(DZP)。除空白组外，其余5组均每天腹腔内注射20%(w/v)酒精(ethanol)1.5 mL/100 g，共28 d，制备酒精戒断焦虑症模型，覆盆子高、中、低剂量组灌胃覆盆子提取物(180，120，60 mg/kg)，阳性药物组灌胃地西泮(5 mg/kg)，每天1次，共给3 d，最后一次给药1 h后，所有大鼠单独在高架十字迷宫(EPM)中进行焦虑行为指标测试。

2.3 行为学指标测试

高空十字架是由2 个开放臂和2个闭合臂以及1个中心部分(10 cm×10 cm)组成。若大鼠在开放臂的时间探索增加，那么其焦虑程度较低，若大鼠在开放臂的探索时间减少，那么其焦虑程度较高。实验室内光线昏暗并保持恒亮，室温24℃，并保持安静。将每只大鼠置于高空十字架(EPM)的正中央(头面向开放臂)释放，大鼠在迷宫中的行为被视频跟踪系统自动记录，每只大鼠测试时间为5 min，实验人员在距离测试箱2 m处观察并记录下大鼠的活动状况。每一只动物完成测试后，清理粪便，并对装置用酒精进行彻底清洁消毒。

测试指标：进入到开放臂次数(OEopen armentry)：即进入到任一开放臂的次数，以大鼠 4 个爪均进入到臂内开始，中途有1个爪从该臂中完全撤出，那么该次进入活动完成；进入到开放臂的时间(OTopen arm time)：进入到开放臂停留的时间，单位：秒(s)；进入到闭合臂次数(CEclose arm entry)：即进入到任一闭合臂的次数，以大鼠 4个爪均进人到臂内开始；进人到闭合臂时间(CTclosearm time)，进入到闭合臂停留的时间，单位：秒(s)。由以上指标分别计算出：①进入到开放臂和闭合臂的总次数(OE+CE)：表示小鼠的自发活动( locomotor activity)；②进开放臂次数比例(OE%)=OE/(OE+CE)×100%；③开放臂停留时间比例(OT%)=OT/(OT+CT)×100%。

2.4 海马中去甲肾上腺素(NE)的含量测定

所有大鼠都完成高架十字迷宫(EPM)测试后，立即将每只大鼠断头处死，剪开颅盖和脑膜，剥离组织后，将大脑放在冰盘上，迅速取出左右两侧海马，称重后，立刻放入-80℃的液氮中保存，之后转移到-80℃低温冰箱里存放。

绘制线性回归方程取去甲肾上腺素(NA)标准品约2.5 mg，精密称定，用0.1 mol/L HClO4溶解并定容到50 mL作为对照品贮备液。精密吸取贮备液10、20、40、80、160 μL，分别稀释成1.25、2.5、5、10、20 ng/μL，以浓度(c)为横坐标(X)，峰面积(A)为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，并进行线性回归，得出回归方程。

海马中去甲肾上腺素(NE)的含量测定在海马样品中加入-4℃保存的0.1 mol/L高氯酸处理液0.1 g/mL，置于冰水混合物中用匀浆机匀浆1 min。将上述物质放入离心机中，以15 000 rpm离心20 min，吸取上清液。将上清液再次以15 000 rpm离心20 min，上清液以0.22 μm的微孔滤膜过滤。以50 μL微型注射器吸取20 μL进样，高效液相色谱系统检测。

色谱条件色谱柱为Kromasi l00-5Cl8(4.6 mm×250 mm)，流动相为甲醇-磷酸二氢钾(0.15 mol/L pH=5.5)=1:9等度洗脱，流速为1 ml/min，室温，波长280 nm，样品中各主要组分用外标法进行定量。

3 实验结果

3.1 覆盆子水提物对大鼠OE%和OT%的影响

表1 覆盆子对EPM大鼠进入开放臂次数比(OE%)、 开放臂停留时间比(OT%)的影响

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

结果显示(表1)：在高架十字迷宫中，与空白对照组相比，酒精戒断大鼠在开放臂的逗留次数、时间明显减少(P<0.01)；与模型组相比，高剂量覆盆子提取物显著地增加其次数、时间(P<0.05)，而中、低剂量覆盆子提取物作用效果不明显(P>0.05)。

3.2 标准曲线

图1 去甲肾上腺素标准品的标准曲线

由图1可以看出去甲肾上腺素的线性回归方程为y=3434x+59283(R2=0.990 4)。

3.3 海马中NA的含量

结果显示(图2)：与空白对照组相比，酒精成瘾大鼠海马中去甲肾上腺素的含量显著升高(P<0.01)，与模型组相比，高剂量覆盆子可降低海马中去甲肾上腺素含量(P<0.05)，中、低剂量覆盆子降低去甲肾上腺素含量的趋势不明显(P>0.05)。

图2 覆盆子提取物对酒精戒断大鼠海马NE含量的影响 注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

4 讨论

许多研究表明，在EPM测试中成瘾的物质包括尼古丁和乙醇，在戒断期间可产生严重的焦虑样行为。自发活动的增加就是一个重要的行为学指标，暗示啮齿类动物的焦虑样行为[18]。本实验结果表明，酒精戒断大鼠可表现出焦虑，其在开放臂停留的时间与对照组相比较短，进入开放臂次数也相对减少。EPM的测试结果对抗焦虑剂敏感，包括经典的抗焦虑药，例如安定、阿普唑仑，对EPM测试中啮齿类动物的焦虑样行为有抑制作用[19]。目前，药物治疗是抗焦虑的最直接治疗方法[20]，然而，众所周知的苯二氮类药物具有很大的局限，近来中草药在治疗情绪障碍如抑郁症和焦虑变得更受欢迎了[21]。据报道，在迷宫实验中酸枣仁可大大改善小鼠的焦虑行为[22]。在目前的研究中，180 mg/kg的覆盆子提取物可明显改善酒精戒断期间大鼠的焦虑行为，而中、低剂覆盆子提取物作用效果不太明显，说明覆盆子提取物对焦虑样行为的作用效果呈剂量依赖性。

与焦虑有密切关系的神经递质主要是单胺类神经递质，主要包括去甲肾上腺素(NA)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)以及它们的代谢产物。大脑去肾上腺素能神经系统(Noradrenergic Brain Systems)与焦虑样行为密切相关。大脑中去肾上腺素能神经元大部分分布在蓝斑(LC)，其纤维投射到大脑皮质和多个皮质下脑区，包括海马、杏核体、下丘脑、背侧丘脑等，该系统兴奋过度会引起明显的恐惧和焦虑样行为。某些可以降低去甲肾上腺素能活动的药物有减轻焦虑的作用[23]。根据一些动物实验观察到，去甲肾上腺素可引起大鼠嗜睡，体温下降，出现摄食行为。某些类型的焦虑可能与去甲肾上腺素神经元的过度兴奋相关。在焦虑患者的血液和脑脊液中发现去甲肾上腺素和它的主要代谢产物3-甲基-4-羟基苯乙二醇(MHPG)浓度升高，焦虑症具有警觉程度增高和交感神经活动增加的表现，显示焦虑症患者去甲肾上腺素能活动增加这种神经解剖结构布局有利于快速广泛地对大脑功能实行调节，对应激环境作出有效回应。在正常情况下，去甲肾上腺素能神经系统可使人体保持一定的警觉性水平，但在乳酸钠、咖啡因、二氧化碳(CO2)等刺激下，该系统过度兴奋则引起明显的恐惧和焦虑样行为。

本实验条件下观察到地西泮和覆盆子均有降低大鼠海马内去甲肾上腺素含量的趋势，提示降低海马中NA的释放，可能是覆盆子抗焦虑作用的重要环节之一。本研究结果显示：与空白对照组比较，模型组大鼠海马组织中去甲肾上腺素含量明显升高，表明焦虑发作时脑内去甲肾上腺素释放增加，与模型组相比较，经治疗后阳性对照组(DZP)和覆盆子组大鼠海马中去甲肾上腺素含量均降低，表明地西泮可减少大鼠焦虑时脑内NE的含量，抗焦虑的作用与此有关，且提示覆盆子对大鼠海马组织的单胺类神经递质有降低作用，其抗焦虑症的作用机制可能与降低脑内海马组织中单胺类神经递质的释放有关。

综上所述，本实验探究覆盆子对酒精戒断期间焦虑样行为和海马中NE水平的作用。覆盆子治疗可缓解焦虑样行为，改善由酒精戒断引起的海马中NE含量的增加。这些结果表明，覆盆子可通过使海马中的去甲肾上腺素能神经系统恢复正常来治疗啮齿类动物酒精戒断期间的焦虑样行为，进一步为覆盆子治疗酒精中毒提供了重要的依据，同时为研制治疗焦虑症的新药奠定了基础[24]。

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