断体地龙促进创伤愈合活性成分筛选研究

段晓杰，杨雨薇，赓迪，罗世林，王雄飞，丁玉婷，郑竹宏，赵仁云，孙毅坤

(北京中医药大学，北京 102488)

据一项最新研究报道，创伤已成为中国除脑中风和冠心病之后的第三大死亡原因[1]。可见创伤已严重威胁到了国人身体健康[2]，需引起高度重视。而传统中医药在治疗创伤愈合方面有着自身独特的优势。地龙，又名“蚯蚓”，作为传统中药，在我国应用已有上千年历史。地龙主要含有酶类、蛋白质、多肽、脂类及微量元素等，有抗凝血、抗血栓、降压、抗肿瘤[3]、解热抗炎镇痛、加速伤口愈合等作用[4]。

课题组前期研究发现，断体三天的地龙提取液含有促进创伤愈合的物质，并发现盐析后得到的饱和度为45%～60%的组分活性最强，本实验将采用DEAE-Sepharose Fast Flow对该组分进行进一步分离，并通过测定其对NIH3T3增殖作用的影响筛选活性较强组分，为探讨断体地龙促进创伤愈合的活性成分奠定基础。

1 实验材料

1.1 实验仪器

核酸蛋白酶检测仪(HD-4，上海沪西分析仪器有限公司);pHS-3C型酸度计(上海伟业仪器厂);万分之一天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司);紫外分光光度计(TU-1901，北京普析通用仪器有限公司);洁净工作台(HD-1360，北京东联哈尔仪器制造有限公司);血球计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司);细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific);倒置显微镜(OPTEC BDS200，重庆市奥特光学仪器有限责任公司);离心机(Anke TDL-50B，上海安亭科学仪器厂);酶标仪(ELX800，湘智离心机厂)。

1.2 实验药材与试剂

盐酸(分析纯，北京化工厂);Tris(C4H11NO3，AMRESCO);氯化钠(NaCl，分析纯，北京化工厂);牛血清白蛋白(AMERSCO);考马斯亮蓝G-250(北京欣经科生物);DMEM培养基(GIBCO公司);Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒，日本同仁化学公司);bFGF(美国Peprotech);双抗(北京拜耳迪生物科技有限公司);胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司);0.25%Trypsin-EDTA(GIBCO公司);25 cm2细胞培养瓶(corning公司);无菌0.22 μm过滤膜等。

赤子爱胜蚓(天津市东丽区成功蚯蚓养殖场);NIH3T3(北京协和细胞资源中心)。

2 实验方法

2.1 DEAE-Sepharose Fast Flow分离蛋白

采用湿法装柱[5]将DEAE-Sepharose Fast Flow装入处理好的层析柱(2.0 cm×17 cm)中，装好的层析柱用10倍量的平衡缓冲液(pH 7.5[6]，0.01 M Tris HCl溶液)充分平衡。样品经0.22 μm滤膜过滤后上样，先后用0.1～0.5 M NaCl溶液梯度洗脱，流速为1 mL/min，检测波长为280 nm，收集各信号峰的洗脱液，低温透析后于-20℃保存。

2.2 蛋白含量测定

采用Bradford法测定蛋白浓度。以牛血清白蛋白为标准蛋白，加入适量考马斯亮蓝染液和去离子水，配制浓度分别为0、3.7、7.4、11.1、14.8、18.5 mg/mL的标准蛋白溶液，分别于595 nm波长处测定吸光度值。分别取200 μL的1～5号洗脱液，用去离子水稀释至1 mL后加入适量染液，用紫外分光光度计测定吸光度。

2.3 活性组分筛选

2.3.1 NIH3T3细胞培养

“速融法”复苏NIH3T3细胞，用DMEM高糖完全培养液(含10%的胎牛血清、1%的双抗)于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养。细胞铺满80%～90%时进行传代培养。

2.3.2 分组与给药方法

实验分为给药组(1～5号给药组)、阴性对照组和阳性对照组。给药组加入含有一定浓度药物的完全培养液，每组均设六个蛋白浓度(分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3 μg/mL)，阴性对照组只加完全培养液，阳性对照组加含有0.1 μg/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的完全培养液，每组设3个复孔，另设调零孔。

细胞生长至对数期后进行传代，Trypan Blue法计数后将细胞稀释至一定浓度，吹打均匀，使得每100 μL含有5 000个左右细胞。按照每孔100 μL将细胞接种到96孔板上，培养箱中培养24 h后取出培养板，弃去旧的培养液，分别加入等量的新鲜的含药培养液、完全培养液及含有bFGF的完全培养液。给药后将培养板放回培养箱中继续培养。

2.3.3 CCK-8法测定细胞增殖率

给药48 h后，取出培养板，同时按照一定比例配制含有CCK-8的完全培养液。弃去旧的培养液，每孔加入含有CCK-8的完全培养液110 μL(含DMEM完全培养液100 μL，CCK-8溶液10 μL)。在培养箱中孵育1.5 h后用酶标仪测定吸光度，计算增殖率。阴性对照组以100%计。

2.4 统计学处理

采用SPSS19.0软件，对数据进行单因素方差分

3 实验结果

3.1 DEAE-Sepharose Fast Flow洗脱图谱

样品经阴离子交换层析分离结果见图1。由图1可知，用0.1 M～0.5 M NaCl溶液梯度洗脱后，一共得到5个洗脱峰(每个浓度均得到一个洗脱峰)。

图1 离子交换层析洗脱图谱注：1：0.1 M NaCl 洗脱峰；2：0.2 M NaCl 洗脱峰；3：0.3 M NaCl 洗脱峰；4：0.4 M NaCl 洗脱峰；5：0.5 M NaCl 洗脱峰

3.2 不同洗脱液的蛋白含量

以牛血清白蛋白浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，得回归方程A=15.598C+0.02(R=0.988 3)。经计算得1～5号洗脱液蛋白浓度分别为0.137、0.150、0.154、0.127、0.165 mg/mL。由此可见各洗脱峰蛋白含量差异较小，峰4含量较低，峰5含量相对较高。

3.3 不同洗脱液对NIH3T3细胞增殖率的影响

洗脱液对NIH3T3细胞增殖作用的影响见表1。由表1可知，在一定浓度下，各洗脱液对NIH3T3细胞均有促进增殖的作用，阳性对照组(bFGF)与实验组、阴性对照组相比具有显著性差异。当蛋白浓度为1.5 μg/mL时，各组细胞增殖率达到最大值，分别为115.39%、115.78%、124.99%、121.58%和109.34%。

表1 不同离子交换成分对NIH3T3增殖率的影响

注：与阴性对照组比较，#P<0.05,##P<0.01

根据表1绘制各实验组细胞增殖率曲线图，见图2。由图2可看出，各实验组细胞增殖率呈现相近的趋势，在蛋白浓度≤1.5 μg/mL时细胞增殖率均随着蛋白浓度的升高而增大，之后随着蛋白浓度的升高增殖率呈下降趋势。其中2、4、5号洗脱液组在蛋白浓度高于2.5 μg/mL时呈现细胞生长抑制的现象。当蛋白浓度为1.5 μg/mL时，各组细胞增殖率均达到最大值，其中3号洗脱液组增殖率最大，且该组在各蛋白浓度下对细胞增殖促进作用较稳定。

图2 不同洗脱液促进NIH3T3细胞的增殖率曲线

4 讨论

创伤愈合主要包括三个阶段：炎症期、肉芽组织形成期和瘢痕形成期[7]。成纤维细胞是肉芽组织形成的关键细胞，其增殖可认为是组织形成的先兆[8]。而bFGF能促进成纤维细胞增殖分化[9],因此实验中以bFGF为阳性对照，通过观察实验组对成纤维细胞增殖作用的影响来筛选提取液中促进创伤愈合的活性成分。

本实验是将课题组前期得到的活性组分通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱进行纯化，采用不同浓度的NaCl溶液梯度洗脱先后得到5个洗脱液。对蛋白进行含量测定后，采用不同浓度的各洗脱液作用于NIH3T3细胞，并通过CCK-8法检测细胞的增殖率。结果发现，3号洗脱液对细胞增殖促进作用最强，且促增殖作用呈浓度依赖关系，但蛋白浓度过高时细胞生长呈现抑制作用。表明其可能含有促进创伤愈合的成分，后期可结合凝胶过滤层析和SDS-PAGE对活性蛋白进行纯化研究。

本研究通过NIH3T3增殖实验筛选促进创伤愈合的活性成分，尚有不足之处，其体内活性及具体作用机制尚不明确，有待进一步的探讨。

[1] 钟世镇.关于创伤急救的几个问题[J].中华神经创伤外科电子杂志,2015,1(2):1-2.

[2] 王正国.创伤医学发展的思路[J].中华神经创伤外科电子杂志,2015,1(1):2-3.

[3] 毛承飞,崔永安,左小东.地龙抗肿瘤研究进展[J].中医药学报,2006,34(5):50-52.

[4] 杜航,孙佳明,郭晓庆,等.地龙的化学成分及药理作用[J].吉林中医药，2014,34(7)：707-709.

[5] 刘冬涵,王炎,田玉欣,等.苦菜地上部分总黄酮富集工艺研究[J].中医药学报，2017,45(2):94-98.

[6] 段晓杰,罗世林,汪文琪,等.地龙提取液中蛋白质的稳定性研究[J].中医药信息,2017,34(2):31-33.

[7] 王羽侬,王顺梅,唐莹,等.中医药促进创面愈合机制研究进展[J].中国医药导报,2014,11(19):156-158.

[8] 魏巍,高建青,于莲.新型局部给药系统促进创伤愈合的研究进展[J].中国现代应用药学,2014,31(11):1417-1423.

[9] 陈佳,罗成群.碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与创伤愈合[J].中国烧伤创疡杂志,2005,17(1):74-76.