当归多糖对染镉大鼠肾氧化损伤和Bcl-2/Bax表达的影响*

雍文兴，颜春鲁，安方玉，伍志伟，苏 韫 ，雒志义，朱俊燚

(1.甘肃中医药大学附属医院急诊科，甘肃 兰州730000； 2.甘肃中医药大学教学实验实训中心，甘肃 兰州 730000； 3.甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州730000； 4.甘肃中医药大学公共卫生学院，甘肃 兰州730000)

近年来，对各种中药、植物及真菌的有效成分多糖的研究逐渐成为热点。大量研究发现，中药多糖、植物多糖和真菌多糖均可以发挥增强免疫力、抗瘤、抗氧化和保护肾功能等功效[1-4]。当归〔Angelicasinensis(Oliv.)Diels 〕归属于伞形科植物当归，其根入药，是补血调血圣药[5]。当归主要含有苯酞类及其二聚体、酚酸类、多糖、黄酮、微量元素等。其中，当归多糖是当归最主要的活性物质[6]，主要包括葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖等。镉(Cadmium，Cd) 作为主要的金属污染物对人体健康的影响已不容忽视，有效防治镉污染成为亟待解决的公共卫生问题。肾脏是镉中毒的最重要的靶器官之一[7]。有研究发现：镉在引起肾发生氧化应激反应的同时，能引发氧化反应损伤[8]。生物体内存在氧化系统和抗氧化系统，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量可直接反映机体的氧化系统的功能，而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性则可以直接反映机体的抗氧化系统的功能[9]。本研究采用当归多糖对染镉大鼠进行干预，以揭示当归多糖对大鼠肾损伤的影响机制，为甘肃道地药材当归的开发、利用，以及镉污染防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级Wistar大鼠36只，体质量(180±20)g，雌雄各半，由甘肃中医药大学科研实验中心提供。实验动物质量合格证编号：SCXK(甘)2011-0001-0001344。

1.2 药品、试剂与仪器

当归为甘肃地道药材，购自甘肃中医药大学附属医院，由甘肃中医药大学科研实验中心药物制剂实验室鉴定、提取、分离，纯度50%以上。当归多糖(ASP)，规格20 mg/kg，天津市大茂化学试剂厂产品，批号110311，用0.5%的羧甲基纤维素钠配成所需质量分数(2 mg/mL)。氯化镉，天津市巴斯夫化工有限公司产品，批号20081010；考马斯亮兰试剂盒，SOD、MDA、LDH、GSH-Px检测试剂盒，均为南京建成生物工程研究所产品，批号依次为20140309，20160621，20160627，20160728，20160628；Rat IL-2 precocated ELISA kit 和Rat TGF-β1 precocated ELISA kit检测试剂盒，均为上海源叶生物科技有限公司产品，批号依次为20160718A，201600721A；Bax和Bcl-2抗体，均为ImmunoWay Biotechnology Company产品，批号 依次B5901，B7001。iMark型全自动酶标分析仪，美国Bio-Rad公司产品；FA2004N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司产品；ZY12306型微量加样器，Scientific赛默飞世尔产品；T6新悦-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；TDZ5-WS型医用离心机，湖南平凡科技有限公司产品；AA320N型原子吸收分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司产品。

1.3 动物分组、模型的建立与给药

将36只大鼠适应性喂养3 d后，按照随机数字表法分为空白对照组、氯化镉染毒组、当归多糖干预组3组，每组12只。空白对照组腹腔注射质量分数9 g/L的NaCl溶液，氯化镉染毒组和当归多糖组均腹腔注射质量分数1 g/L的氯化镉(1.5 μg/g)，每周5次，共5周。当归多糖组染毒的同时给予当归多糖20 μg/g灌胃治疗，1 d 1次，连续5周。末次给药后，取血、肾脏备用。

1.4 检测指标

末次给药24 h后，称量体质量，股动脉采血，处死大鼠。

1.4.1 肾指数

分离肾脏,称量质量，计算肾指数。肾指数=肾脏质量(mg)/体质量(g)。

1.4.2 血清SOD、MDA、LDH和GSH-Px

股动脉采集血样，室温静置2 h，1 500 r/min离心10～20 min，制备血清。采用羟胺法测定SOD 活性，检测波长为 550 nm；采用TBA法测定MDA的含量，532 nm；采用苯甲酸显色法测定GSH-Px的活性，检测波长为 422 nm；采用GENMED显色和底物NAD+的生成量测定LDH的活性，检测波长为340 nm。

1.4.3 肾组织SOD、MDA、LDH、GSH-Px和Cd

冰浴条件下按照1∶9的比例制备肾组织匀浆液，1 500 r/min离心15min，取上清，分别测定肾组织SOD、MDA、LDH、GSH-Px和Cd，其中SOD、MDA、LDH和GSH-Px的测定方法同1.4.2，Cd含量的测定采用火焰原子吸收光谱法。

1.4.4 肾组织IL-2和TGF-β1

取少量1.4.3中分离的上清液，采用ELISA法测定肾组织IL-2和TGF-β1含量，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.5 肾组织Bcl-2和Bax

剥离肾组织，生理盐水冲洗后制作石蜡包块，切片厚度为4～5 μm。切片脱水，微波修复20 min，3%过氧化氢室温孵育30 min，5% BSA室温30 min， 加入 Bax 和 Bcl-2 抗体(1∶200)，4 ℃过夜后加入二抗，室温孵育 1 h，DAB显色，封片，在400倍下观察Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠肾指数对比

与空白对照组对比，氯化镉染毒组大鼠肾指数升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与氯化镉染毒组对比，当归多糖组大鼠肾脏指数降低，但差别无统计学意义(P>0.05)。见表1。

组 别剂量/(μg·g-1)肾脏指数/(mg·g-1)空白对照组—0．59±0．02氯化镉染毒组—0．75±0．10∗∗∗当归多糖组200．65±0．26#

注：与空白对照组对比，***P<0.01；与氯化镉染毒组对比，#P>0.05

2.2 各组大鼠血清和肾组织SOD活性、MDA含量对比

与空白对照组对比，氯化镉染毒组大鼠血清和肾组织SOD活性均降低，MDA含量均升高,差别有统计学意义(P<0.01)。与氯化镉染毒组对比，当归多糖组大鼠血清和肾组织SOD活性均升高，MDA含量均降低，差别有统计学意义(P<0.01)。见表2。

组 别剂量/(μg·g-1)血清SOD/(U·mL-1)MDA/(μmol·L-1)肾SOD/(U·mL-1)MDA/(μmol·L-1)空白对照组—125．79±0．4113．97±1．2871．55±3．563．96±0．79氯化镉染毒组—81．46±0．64∗∗∗21．15±1．05∗∗∗39．30±3．36∗∗∗7．47±0．78∗∗∗当归多糖组20106．01±0．81###15．84±1．21###58．76±2．35###5．30±0．98###

注：与空白对照组对比，***P<0.01；与氯化镉染毒组对比，###P<0.01

2.3 各组大鼠血清和肾组织 GSH-Px、LDH活性对比

与空白对照组对比，氯化镉染毒组大鼠血清和肾组织GSH-Px活性降低，LDH活性升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与氯化镉染毒组对比，当归多糖组大鼠血清和肾组织 GSH-Px活性升高，LDH活性降低(P<0.01)。见表3。

组 别剂量/(μg·g-1)血清GSH-Px(U·mL-1)LDH/(U·mL-1)肾GSH-Px/(U·g-1)LDH/(U·g-1)空白对照组—129．22±9．02929．93±78．94240．48±18．241125．2±37．91氯化镉染毒组—85．54±6．83∗∗∗1536．82±83．98∗∗∗159．26±21．06∗∗∗2089．46±35．87∗∗∗当归多糖组20113．99±10．72###1256．53±128．64###209．38±20．42###1184．96±12．65###

注：与空白对照组对比，***P<0.01；与氯化镉染毒组对比，###P<0.01

2.4 各组大鼠血清 IL-2、TGF-β1和Cd活性对比

与空白对照组对比，氯化镉染毒组大鼠血清IL-2含量降低，TGF-β1和肾组织Cd含量升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与氯化镉染毒组对比，当归多糖组大鼠血清IL-2含量升高，血清TGF-β1含量和肾组织Cd含量降低(P<0.01)。见表4。

组 别剂量/(μg·g-1)IL-2/(ng·L-1)TGF-β1/(ng·L-1)Cd/(μg·g-1)空白对照组—117．38±10．894．88±0．380．02±0．01氯化镉染毒组—71．82±14．82∗∗∗9．77±0．21∗∗∗19．68±1．85∗∗∗当归多糖组20114．84±8．36###5．26±0．31###12．11±0．95###

注：与空白对照组对比，***P<0.01；与氯化镉染毒组对比，###P<0.01

2.5 镉染毒大鼠肾组织Bcl-2和Bax蛋白表达的变化

与空白对照组对比，氯化镉染毒组大鼠肾组织中Bcl-2表达下降，Bax表达升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与氯化镉染毒组对比，当归多糖组大鼠肾组织Bcl-2表达升高，Bax表达降低 (P<0.01)。见表5和图1。

组 别剂量/(μg·g-1)Bcl-2Bax空白对照组—37．54±3．2357．87±8．93氯化镉染毒组—68．43±5．21∗∗∗27．54±5．45∗∗∗当归多糖组2042．34±2．82###58．94±6．75###

注：与空白对照组对比，***P<0.01；与氯化镉染毒组对比，###P<0.01

1.Bcl-2；2.Bax；A.空白对照组；B.氯化镉染毒组；C.当归多糖治疗组图1 各组大鼠肾组织Bcl-2和Bax蛋白表达结果(免疫组化，400×)

3 讨 论

金属镉通常被机体以金属硫蛋白的形式选择性地沉积于肾脏等重要脏器中[10]。肾既是镉的排泄器官，也是镉的存贮器官。随着镉污染的加重，镉中毒性肾病越来越多，究其原因：其一，镉以金属硫蛋白的形式在经肾小球滤过、肾小管重吸收的过程中，被重新释放出来而损伤细胞；其二，镉可结合机体酶或蛋白分子中的许多活性基团，在影响其生物活性的同时，导致器官损伤。因此，肾脏成为镉致机体毒性作用的主要靶器官和研究热点。

本研究采用腹腔注射氯化镉染毒，以肾为研究重点，通过检测大鼠肾Cd含量，证明镉暴露可以使大鼠的肾功能发生损伤。有研究[11]证明：细胞凋亡在镉细胞毒性中发挥关键作用。为此，本研究采用免疫组化法测定了肾组织Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表达水平， 发现抑凋亡蛋白Bcl-2表达是降低的，促凋亡蛋白Bax是增高的，提示镉对肾组织的毒性可能是通过凋亡途径实现的。但是，镉毒性的具体机制尚不清楚。目前，大量研究发现，氧化应激在镉暴露导致的肾损伤中起着重要作用[12]，可能是由于镉可以置换SOD等抗氧化酶的活性巯基[13]，也可结合GSH、MT等含巯基的物质， 打破机体氧化/抗氧化平衡[14]，诱发氧化应激损伤[15]，最终使机体发生不可逆性损伤。氯化镉使肾组织LDH漏出增多，进一步损伤肾组织。因此，氧化损伤和线粒体毒性可能是镉致肾细胞毒性损伤的主要机制[16]。

本研究结果显示：氯化镉染毒组大鼠血清和肾组织中SOD、GSH-Px活性下降；LDH活性和MDA含量升高，肾组织中Cd含量、TGF-β1含量和Bax表达升高，IL-2含量和Bcl-2表达降低(P<0.01)。当归多糖组大鼠血清和肾组织中SOD、GSH-Px活性升高；LDH活性和MDA含量下降，肾组织中Cd含量、TGF-β1含量和Bax表达降低，IL-2含量和Bcl-2表达升高(P<0.01)。结果表明：凋亡相关蛋白和细胞因子的参与可能是导致镉中毒机体发生肾氧化应激损伤的根本原因。当归多糖的治疗机制可能是通过调控机体的凋亡来实现机体氧化和抗氧化系统之间的平衡，从而发挥保护肾损伤的功效，但其具体作用机制尚有待于在分子生物学实验中作进一步探讨。

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