白花蛇舌草对Ⅱ型胶原蛋白诱导的大鼠类风湿性关节炎的治疗作用*

贾 鹏， 刘 未， 刘 生， 高 巍

(中国人民武装警察部队特色医学中心骨科， 天津 300162)

类风湿性关节炎(rheumatoid Arthritis，RA)是一种全身炎症性自身免疫性疾病，涉及多个系统，累及多个关节，主要靶组织是关节滑膜，主要临床症状表现为关节功能下降、肿胀、疼痛，病变会持续反复发作，严重影响患者的身心健康，降低生活质量[1]。RA多发于30岁以后，女性发病率高于男性。RA没有明确的发病机制，可能涉及内分泌、遗传和感染等因素，临床也没有发现特效治疗药物。控制疼痛是RA治疗的首要环节，也是判定药物疗效的标准之一。中药组方痹肿消汤、益气解毒化瘀汤具有治疗类风湿性关节炎的作用，其单味中药白花蛇舌草(hedyotis diffusa Willd., HD)具有治疗RA相关的抗炎作用和免疫调节功能，为进一步探讨其作用机理，本研究采用Ⅱ型胶原蛋白建立胶原诱导性(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，给予白花蛇舌草进行治疗，观察其对CIA大鼠关节炎症的影响，以期为临床RA治疗提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 动物和药品

雄性SD大鼠60只，SPF级，体质量180～200 g，由北京维通利华实验动物中心提供。饲养室温25℃左右，明暗交替12 h，自由摄食饮水。弗氏完全佐剂(FAC，SIGMA公司)、Ⅱ型胶原蛋白(SIGMA公司)、白花蛇舌草片(天津市中药饮片厂，国药准字Z36020632)、雷公藤多苷片(福建汇天生物药业有限公司)。TNF-α试剂盒(上海基免实业有限公司)、IL-Iβ试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)、PGE2试剂盒(上海研谨生物科技有限公司)、RANKL试剂盒(上海丰寿实业有限公司)、0PG试剂盒(上海乔羽生物科技有限公司)。

1.2 分组、给药

60只大鼠，按体重随机分为对照组、模型组、雷公藤多苷6 mg/kg组、白花蛇舌草3、6、12 g/kg组，每组10只。除对照组外，将Ⅱ型胶原蛋白用弗氏完全佐剂(FAC)配成3.0 mg/ml的乳化剂，在大鼠距离尾巴根部2 cm背部皮内注射乳化剂，200 μl/只，并于第7日在大鼠距离尾巴根部2 cm背部皮内注射乳化剂100 μl/只进行二次免疫，复制大鼠CIA模型[2-4]。其中，对照组大鼠在相同部位相同间隔时间注射同等体积的生理盐水。造模的当日开始给药，对照组、模型组大鼠给予同容积生理盐水。所有大鼠每天称重，按体重灌胃给药，给药体积5 ml/kg，连续给药4周。模型组初次免疫21 d，关节炎指数评分为6分及以上可判定造模成功。

1.3 关节炎指数测定

测定各组大鼠治疗后1～4周时的关节炎指数。大鼠胶原诱导性关节炎模型关节炎症一般出现在初次注射胶原后2周左右，3周左右最为明显，肿胀持续时间5～8周。注射胶原的后肢首先出现红肿，其余肢体相继受累。大鼠关节炎症状表现为食欲减退，体重下降，毛发无光泽。关节炎病变严重程度用关节炎指数表示。大鼠关节炎采用0～4级关节评分法，根据受累关节红肿程度以及肿大、变形情况进行评分。大鼠关节炎0～4级关节评分标准：0分，无肿胀；1分，足小趾关节出现轻微肿胀；2分，小趾关节以及足跖肿胀；3分，踝关节以下的足爪出现肿胀；4分： 踝关节及其他所有趾甲、关节全部肿胀。采用评定标准对大鼠四肢关节进行评定，关节炎分数为四个关节病变评分总和，最高计16分。

1.4 热痛阈测定

测定各组大鼠治疗前、治疗后1～4周时的热痛阈值。使用光照鼠尾测痛仪，测定造模前，造模后各时间点大鼠热痛阈值。鼠尾测痛仪温度调整为55℃，将大鼠鼠尾放入凹槽内，于距鼠尾尖0.5 cm处连续照射，大鼠由照射开始到鼠尾甩动的时间即为大鼠的热痛阈。

1.5 血浆炎性因子IL-lβ、TNF-α、PGE2、RANKL 和OPG水平测定

大鼠治疗4周时，大鼠麻醉，固定，剖开腹腔，游离腹主动脉，用一次性注射器腹主动脉穿刺取血， 5 000 r/min离心10 min，吸取上清液，-20℃冻存。严格按照试剂盒说明书操作，用酶标仪读取吸光度值，根据标准曲线读取样品中IL-lβ、TNF-α、PGE2、RANKL 和OPG水平。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 白花蛇舌草对关节炎大鼠关节炎指数的影响

与对照组比较，模型组关节炎指数明显增加(P<0.01)；与模型组比较，雷公藤多苷组和白花蛇舌草高剂量组给药2周开始关节炎指数明显降低(P<0.05)，白花蛇舌草低、中剂量组给药3周开始关节炎指数明显降低(P<0.05，表1)。

GroupWeeks of treatment1 week2 week3 week4 weekControl 0 0 0 0Vehicle9.40±0.97∗∗8.60±0.84∗∗7.80±1.99∗∗7.10±1.97∗∗GTW9.10±0.997.50±1.08#6.00±1.49#5.00±0.94##HD low dose8.80±1.148.10±2.226.00±1.56#5.20±1.23#HD middle dose9.00±1.337.60±1.515.60±1.65#4.90±1.45#HD high dose8.70±1.257.30±1.42#5.70±1.83#4.80±1.14##

**P<0.01vscontrol group；#P<0.01,##P<0.01vsvehicle group

2.2 白花蛇舌草对关节炎大鼠热痛阈的影响

与对照组比较，模型组大鼠造模1周开始热痛阈值明显降低(P<0.01)；与模型组比较，雷公藤多苷组和白花蛇舌草高剂量组给药2周开始热痛阈明显升高(P<0.05)；白花蛇舌草低、中剂量组给药3周开始热痛阈明显升高(P<0.05，表2)。

GroupWeeks of treatment0 week1 week2 week3 week4 weekControl16.9±1.516.6±1.816.7±1.417.1±1.416.8±1.9Vehicle17.1±1.910.9±1.7∗∗9.2±1.1∗∗8.7±1.4∗∗8.2±1.3∗∗GTW17.0±1.810.7±1.811.1±2.0#12.5±1.6##13.5±2.0##HD low dose17.1±2.010.8±1.410.1±1.010.5±1.8#Δ10.2±1.5#ΔΔHD middle dose17.2±2.111.1±1.710.5±1.810.6±1.7#Δ11.2±1.8##ΔHD high dose17.3±1.811.0±1.911.4±2.8#11.7±2.7##14.0±2.4##▲▲○○

**P<0.01vscontrol group；#P<0.01,##P<0.01vsvehicle group;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vsGTW group;▲▲P<0.01vsHD low dose group;○○P<0.01vsHD middle dose group

2.3 白花蛇舌草对关节炎大鼠TNF-α、IL-1β、PGE2水平的影响

与对照组相比，模型组血清TNF-α、IL-1β、PGE2水平明显升高(P<0.01)；与模型组相比，雷公藤多苷组、白花蛇舌草各剂量组血清TNF-α、IL-1β、PGE2水平明显降低(P<0.05，表3)。

GroupTNF-α IL-1βPGE2Control21.42±3.3811.27±2.9575.5±12.4Vehicle63.59±8.06∗∗55.35±7.16∗∗213.4±18.7∗∗GTW46.67±5.19##41.61±5.47##159.0±12.6##HD low dose54.53±7.12#Δ49.25±7.67Δ169.5±21.5##HD middle dose50.87±6.47##47.97±7.14#Δ163.8±13.9##HD high dose40.24±4.40##ΔΔ▲▲○○39.82±8.22##▲○138.0±16.9##ΔΔ▲▲○○

TNF-α: Tumor necrosis factor α； IL-1β: Interleukin 1β; PGE2: Prostaglandin

**P<0.01vscontrol group；#P<0.01,##P<0.01vsvehicle group;ΔP<0.05vsGTW group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsHD low dose group;○P<0.05,○○P<0.01vsHD middle dose group

2.4 白花蛇舌草对关节炎大鼠RANKL及OPG水平的影响

与对照组相比，模型组血清RANKL、OPG及RANKL/OPG水平明显升高(P<0.05)；与模型组相比，雷公藤多苷组、白花蛇舌草各剂量组血清RANKL、OPG及RANKL/OPG水平显著降低(P< 0.05，表4)。

GroupRANKL(pg/ml)OPG(pg/ml)RANKL/OPG(%)Control11.8±2.012.1±2.41.00Vehicke96.7±15.7∗∗71.7±10.5∗∗1.35∗∗GTW52.5±8.6##52.7±8.1##1.03##HD low dose58.7±9.5##60.6±5.8##Δ0.98##HD middle dose54.4±8.5##54.3±6.2##▲1.02##HD high dose47.4±7.6##▲▲50.0±7.1##▲▲0.97##

RANKL: Receptor activator for nuclear factor-kappa B ligand; OPG: Osteoprotegerin

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsvehicke group;

ΔP<0.05vsGTW group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsHD low dose group

3 讨论

RA是一种临床常见的慢性自身免疫性疾病，细胞因子在RA发病、发展、预后及药物干预过程中发挥着重要的作用，是引起RA损伤的重要介质[5]。II型胶原诱导性关节炎发病机制、临床症状和免疫特点与人类关节炎相近。

TNF-α、IL-1β是RA发病过程中重要的炎性因子，可以与细胞膜上Toll样蛋白受体结合，识别TNF受体，使I-κB磷酸化，从而激活核因子κB，启动相关因子的转录程序，参与细胞的免疫应答反应。TNF-α、IL-1β能够诱导IL-6的合成，促进IL-6分泌，从而提高滑膜细胞和成骨细胞中NF-κB活化因子配体的释放，从而促进破骨细胞生成因子的表达。因此，抑制TNF-α、IL-1β的合成对控制RA进展具有重要意义。TNF-a由滑膜、软骨血管翳的巨噬细胞产生，能够向上调节滑膜细胞中的细胞因子、PGE2等。IL-1对于滑膜细胞及浸润的淋巴细胞具有增殖和分化作用，有助于促进花生四烯酸的生成，可导致PGE2及胶原酶的合成与释放[6]。

RA骨折风险增高，主要原因就是骨破坏，在RA早期如何有效地抑制或延缓骨破坏的发生、发展是RA防治的重点。破骨细胞在RA骨破坏机制中发挥着重要作用，破骨细胞分化因子RANKL和破骨素OPG是调控破骨细胞激活、分化、骨吸收活性的核心因子。RANKL可以与破骨细胞分化因子受体结合刺激破骨细胞的分化、增殖，并抑制其凋亡[7]；OPG是肿瘤坏死因子受体超家族中一员[8]，是一种可溶性蛋白质，是RANKL的天然阻断受体，能竞争性的结合RANKL，阻断其与受体的结合，抑制破骨细胞的分化、增殖，RANKL/OPG环路是调节骨代谢的重要途径。RA患者血液、关节滑膜液RANKL水平增高，OPG水平降低[9]。本研究模型组大鼠血液RANKL、OPG和RANKL/OPG水平与对照组比较均显著升高，说明该时间段RA大鼠诱导骨破坏的关键因子占主导地位，同时具有骨保护的因素也在升高，RANKL/OPG比值显著升高说明RANKL升高的幅度大于OPG升高的幅度，骨破坏是增加的。

疼痛是类风湿性关节炎最突出的症状，检测指标有热痛和机械痛，本实验检测热痛。痛阈是目前被广泛采用以判断镇痛效果的指标。当免疫功能异常时，脊髓胶质细胞激活，释放出TNF-α、IL-1β等多种致痛物质，一方面可以直接作用于痛觉神经元，增加其兴奋性，向高级中枢传递疼痛信号，另一方面可以降低神经元的兴奋阈值，造成中枢敏化，使激活伤害性感受器的刺激强度降低。此外，这些细胞因子还可以作用于胶质细胞本身，产生正反馈作用，进一步增加细胞因子的数量，造成持续性疼痛。TNF-α、IL-1β在脊髓痛觉调制中起重要作用。内源性TNF-α参与大鼠早期痛觉超敏的发生，将外源性TNF-α导入正常SD大鼠L5DRG中，TNF-α会引发疼痛，诱发痛觉超敏。Wistar大鼠鞘内注射IL-1β会诱发痛觉超敏，脊髓中IL-1β可以通过增加NR1亚基的磷酸化来易化疼痛。IL-1β也可在环氧化酶的作用下，上调脊髓中致痛物质PGE2的表达。

雷公藤多苷是传统中药雷公藤的主要有效成分，具有强大的抗炎以及免疫抑制作用，已广泛应用于临床治疗多种自身免疫性疾病[10]，这里作为阳性对照药。

白花蛇舌草为清热解毒药，是痹肿消汤中的君药之一，具有抗炎、抗肿瘤、调节免疫、保肝利胆等生物活性。白花蛇舌草治疗RA主要包括调节免疫，下调炎症因子水平，抑制血管新生等作用，对RA患者体外滑膜细胞的增殖具有抑制作用。

综上所述，白花蛇舌草可明显降低RA大鼠的关节炎指数、升高痛阈，并且呈现出剂量依赖性的作用趋势，此作用与下调血液TNF-α、IL-1β和PGE2水平，抑制RANKL、OPG、RANKL/OPG水平，从而达到有效防治大鼠RA的目的。