孕康口服液对胚胎着床障碍大鼠的安胎作用*

郑 祥， 郭林峰， 戴明珠， 吕圭源， 陈素红, 3△

(1. 温州医科大学药学院， 浙江 温州 325035； 2. 浙江中医药大学现代中药与健康产品研究所， 杭州 310053； 3. 浙江工业大学长三角绿色制药协同创新中心， 杭州 310014)

近年来不孕症的发病率明显逐年上升，据世界卫生组织统计，不育夫妇占已婚育龄夫妇的7%～15%[1]。以体外受精-胚胎移植为代表的辅助生殖技术的孕育成功率仅维持在30%，胚胎着床障碍是主要原因[2]，改善胚胎着床障碍对提高辅助生殖技术的成功率和治疗不孕症具有重要意义[3]。孕康口服液(Yun Kang oral liquid，YK)是已上市的中成药，具有补肾培元、益气健脾、养血安胎之功效，临床上用于肾虚型和气血虚弱型的先兆流产和习惯性流产[4]。在妊娠初期，常因卵巢黄体分化、孕酮水平异常等，导致胚胎着床障碍[5]。本课题组前期发现孕康口服液能改善肾虚致流产模型大鼠的症状，促进卵巢黄体分化，提高雌激素、孕酮等激素水平[6]。因此，本实验采用米非司酮致胚胎着床障碍大鼠模型[7]，进一步观察孕康口服液的安胎作用，为其临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD大鼠，雌70只，体重(260±20)g；雄30只，体重(280±20)g。由浙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号：1703020027，许可证号：SCXK(浙)2014-0001。

1.2 试验药物

回音必®孕康口服液(批号16070102)，现用现开，回音必集团浙江齐齐制药有限公司；地屈孕酮片(批号352536)、米非司酮片(批号170101)，浙江省中医院西药房提供。

1.3 试剂

卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白介素-4(interleukin-4，IL-4)测试盒，批号均为E20170101A，上海源叶生物科技有限公司；HE试剂盒(批号20160918)，南京建成科技有限公司。

1.4 仪器

全自动生化分析仪(TBA-40FR)，日本东芝医疗系统株式会社；酶标仪(Powerwave 340)，美国Bio-TEK公司；组织脱水机(JJ-12J)，武汉俊杰电子有限公司；切片机(RM2245)，德国LEICA公司；生物显微镜(B-5223IEP)，Motic公司。

1.5 动物分组

每天下午5点，将一定数量的处于发情期或发情前期的雌鼠与雄鼠进行合笼交配，每笼雌鼠与雄鼠的数量比例为1∶1，次日晨对合笼后的雌鼠进行阴道栓检查，以发现有阴道栓者记为雌鼠妊娠的第1日。将出现阴道栓的大鼠按体重随机分为6组：正常对照组(NC)，模型组(MG)，地屈孕酮组(DT，3.02 mg/kg)，孕康口服液低剂量组(YK-L，4 ml/kg)、中剂量组(YK-M，6 ml/kg)、高剂量组(YK-H，9 ml/kg)，每组11只。

1.6 模型的建立及处理

从妊娠第1日起，除NC组、MG组灌服纯化水外，其余各组按规定剂量灌服相应受试药，每天1次，连续10 d；期间在妊娠第3日，除NC组外，其余各组按5 mg/kg体质量颈背部皮下注射米非司酮溶液建成实验模型。妊娠第10日，水合氯醛麻醉后开腹暴露子宫，腹主动脉采血备用，并取完整双侧卵巢、连胎子宫等备用。

1.7 检测指标

体重：实验全程每天称量并记录妊娠大鼠体重。

脏器指数测定：妊娠大鼠称重、取血后，处死大鼠，解剖取卵巢、连胎子宫，计算脏器指数=脏器质量/体重×100%。

胚胎着床数目：记录胚胎着床数目。

连胎子宫形态观察(拍照)：颜色，有无粘连、瘀血，有无丢失胚胎等。

血清指标：采用酶联免疫吸附试验法测定血清中FSH、IFN-γ、IL-4。检测原理，预先包被抗体的微孔中依次加入材料，经温育、洗涤，用底物TMB显色，颜色深浅与待测指标成正相关。

连胎子宫病理学观察：孕鼠连胎子宫用4%中性福尔马林缓冲溶液固定24 h，经脱水后，切制成4m厚的石蜡切片，HE染色，光镜下观察组织病理学变化，拍照记录并分析。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 孕康口服液对体重的影响

实验结果显示，与NC组比较，MG组给药第6日体重明显降低(P<0.05)，至第9日显著降低(P<0.01)；与MG组比较，YK-M组仅第9日体重明显升高(P<0.05)，DT组和YK-H组第6、9日体重均显著性升高(P<0.05，0.01)，YK-L组则差异无显著性；与DT组比较，YK各给药组体重均无明显差异(表1)。

2.2 孕康口服液对连胎子宫形态的影响

实验结果显示，NC组胚胎着床数目多，连胎子宫粗大如串珠状呈粉红色，宫内未见瘀血；MG组胚胎着床数目少，连胎子宫呈竹节样改变，或见坏死胚胎，或胚胎呈黑褐色，或无胚胎仅有胚胎着床点；YK-L组较MG组状态佳，DT组和YK-M、YK-H组胚胎着床数目、连胎子宫形态均与NC组接近，其中YK-H组连胎子宫形态优于DT组(图1)。

GroupNumber of days of pregnancy(d)1369NC280.3±18.2292.6±17.2305.1±14.3318.5±12.5MG283.4±18.7290.8±21.4292.8±11.4∗301.0±17.1∗∗DT280.7±16.7294.7±15.3302.7±14.8#317.2±14.3#YK-L282.5±16.6295.9±15.3301.6±15.6310.7±16.9YK-M284.4±17.8295.1±20.9303.3±16.6319.1±18.7#YK-H287.1±17.6295.8±15.7307.0±15.2#320.9±14.0##

NC: Normal control; MG: Model group; DT: Dydrogesterone; YK: Yun Kang oral liquid; L: Low dose group; M: Middle dose group; H: High dose group

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P< 0.01vsmodel group

Fig.1Effects of Yun Kang liquid on uterine morphology in embryo implantation dysfunction rats

A: Normal control B: Model group C: Dydrogesterone

D: YK-L E: YK-M F: YK-H

2.3 孕康口服液对卵巢、连胎子宫指数及胚胎着床数目的影响

实验结果显示，与NC组比较，MG组连胎子宫指数、胚胎着床数目显著降低(P<0.01)；与MG组比较，DT组和YK-M、YK-H组连胎子宫指数、胚胎着床数目均显著性升高(P<0.05，0.01)，YK-L组则差异无显著性；与DT组比，YK-H组连胎子宫指数、胚胎着床数目无显著性差异。其中，YK-H组胚胎着床数目显著高于YK-L和YK-M组(P<0.05， 0.01)，提示可能存在剂量依赖性。各组间卵巢指数无显著性差异(表2)。

GroupOvarian index(mg/g)Uterine index(mg/g)Embryo implantation number(number)NC0.24±0.044.46±0.4516.27±2.41MG0.25±0.042.01±0.50∗∗5.64±3.64∗∗DT0.25±0.023.02±0.22##11.36±2.58##YK-L0.26±0.042.34±0.447.82±4.12YK-M0.24±0.022.66±0.53##9.45±3.78#YK-H0.26±0.022.98±0.30##12.82±2.86##△△▲

NC: Normal control; MG: Model group; DT: Dydrogesterone; YK: Yun Kang oral liquid

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△△P<0.01vsYK-L;▲P<0.05vsYK-M

2.4 孕康口服液对FSH及IFN-γ(Th1)、IL-4(Th2)的影响

实验结果显示，与NC组比较，MG组血清FSH、IL-4水平明显降低(P<0.05)；与MG组相比，YK-M、YK-H组血清FSH、IL-4水平均明显升高(P< 0.05)，DT组和YK-L组则差异无显著性。各组间血清IFN-γ水平无显著性差异(表3)。

GroupFSH(IU/L) IFN-γ(pg/ml)IL-4(pg/ml)NC8.08±2.2269.53±17.9637.86±15.14MG6.51±0.60∗66.77±8.7327.64±8.59∗DT6.61±0.6772.00±7.4133.08±8.03YK-L7.02±0.7969.95±10.7332.69±4.27YK-M7.03±0.73#64.23±6.5334.62±4.85#YK-H7.10±0.81#67.31±11.1335.62±11.59#

NC: Normal control; MG: Model group; DT: Dydrogesterone; YK: Yun Kang oral liquid; FSH: Follicle stimulating hormone; IFN-γ: Interferon-γ; IL-4: Interleukin-4

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

2.5 孕康口服液对连胎子宫病理切片的影响

实验结果显示，NC组子宫内膜层几乎完全由圆形、类圆形单层柱状上皮覆盖；MG组子宫内膜腺体扩张，腺上皮增生、鳞状化，腺腔内炎性细胞浸润；YK-L、YK-M组部分腺体扩张，YK-H组单层柱状上皮微鳞状化，YK各给药组腺上皮增生、腺腔内炎性细胞浸润明显改善(图2)。

3 讨论

胚胎着床是体外受精-胚胎移植生殖技术和正常妊娠过程中的关键步骤之一，子宫内膜容受性是其中重要的制约因素[8]。子宫内膜仅在一个极短的时间段内允许发育到特定阶段的胚胎黏附在子宫内膜上，在这个短暂的“窗口”时间内，子宫内膜与胚胎需发育同步才能形成最优的子宫内膜容受性，使胚胎顺利着床，否则会导致胚胎着床障碍，造成流产[7]。本实验大鼠在妊娠第3日颈背部皮下注射米非司酮，通过竞争性结合孕激素受体，造成下丘脑-垂体-性腺轴的紊乱，使机体激素异常分泌，导致子宫内膜发育受到抑制而干扰着床[9]。本研究结果显示，MG组胚胎着床数目和连胎子宫指数均显著降低，连胎子宫形态异常，子宫内膜病变明显，成功构建了胚胎着床障碍大鼠模型。

Fig.2Effects of Yun Kang oral liquid on uterine morphology in embryo implantation dysfunction rats

A: Normal control; B: Model group; C: Dydrogesterone; D: YK-L; E: YK-M; F: YK-H; 1: HE ×100; 2: HE ×400

孕康口服液是根据安徽省名老中医杨新吾先生的验方“无忧保胎方”研制而成[10]，2015版中国药典将其收录为孕康合剂(孕康口服液)，临床上用于先兆流产和习惯性流产[11]。孕康口服液具有补肾培元、益气健脾、养血安胎之功效。现代药理研究表明[12]，补肾方药能调节下丘脑-垂体-性腺轴功能，改善子宫内膜环境，增强子宫内膜容受性，从而提高妊娠率。本实验结果显示，YK-M、YK-H组和DT组均能显著性升高胚胎着床数目和连胎子宫指数，且YK-M、YK-H组与DT组比均无显著性差异；YK-H组胚胎着床数目显著高于YK-L组和YK-M组，提示孕康口服液可能存在剂量依赖性，但还需进一步研究。同时，YK-H可使连胎子宫形态趋于正常化，子宫内膜病变明显改善，利于安胎。

女性的生殖功能是在下丘脑-腺垂体-卵巢轴的共同调节下完成的，生殖轴中任何激素含量的改变都将影响生殖功能[13]，性成熟的子宫内膜功能层的周期变化也受到下丘脑-垂体-卵巢轴的调节，并与卵巢内相应的卵泡周期性活动密切相关[14]。本实验结果表明，与MG组比，YK-M、YK-H组均可升高血清FSH水平，DT组则差异无显著性，提示孕康口服液可通过升高血清FSH水平刺激卵巢内卵泡发育成熟，促使黄体形成，改善子宫内膜容受性，利于胚胎着床[15]。子宫内膜的变化不仅需要性激素的调节，还需要免疫系统参与其中[16]。在正常月经周期子宫内膜生长、分化、脱落和胚胎着床生长的内膜重建过程中，免疫细胞及其分泌的细胞因子发挥着重要作用[17-19]，其中Th1/Th2的平衡与妊娠成功密切相关，Th1型细胞因子如IFN-γ和IL-2过多会导致流产和反复流产，Th2型细胞因子如IL-4和IL-10有利于正常着床和妊娠，甚至妊娠成功被称为是一种“Th2现象”[20]。本实验研究表明，与MG组比，YK-M、YK-H组均可明显升高血清IL-4水平，表现为Th2型优势，促进胚胎着床，利于妊娠，而DT组则差异无显著性。

综上所述，孕康口服液高剂量组能显著性提高胚胎着床数目和连胎子宫质量，升高血清FSH、IL-4水平，改善子宫内膜组织学形态，从而提高子宫内膜容受性，显示出优于地屈孕酮的安胎效果。孕康口服液可能通过调节激素水平和改善免疫细胞因子两个方面促进胚胎着床，改善子宫内膜环境，提高胚胎数目和质量，从而增加妊娠成功率，其机制有待更深入一步的研究，这为孕康口服液的临床应用提供了一定的科学依据。