AdipoRon对2型糖尿病小鼠肾脏损伤的干预作用*

黄 玲， 屈小虎， 陈 慧， 谢克俭， 肖 敏

(温州医科大学检验医学院 生命科学学院， 浙江 温州 325035)

胰岛素敏感性降低即胰岛素抵抗是2型糖尿病发病机制的重要环节。胰岛素敏感组织的葡萄糖摄取量减少和胰岛β细胞功能降低是2型糖尿病的特征性病理生理学改变。目前发现脂联素受体激动剂(AdipoRon)具有抗糖尿病的生物学活性：研究[1]表明，AdipoRon通过多条信号通路，加快肌肉组织中游离脂肪酸的氧化和葡萄糖的转运，实现增加脂肪酸的β氧化、改善胰岛素抵抗[2]和抗炎等生物学作用。同时，增强肾脏组织中脂肪氧化，从而降低脂质合成，发挥抗氧化作用。研究发现， 在小鼠骨骼肌组织中AdipoRon 通过结合 AdipoR1/2，可抑制体内糖异生过程，促进脂肪代谢[3，4]。本研究在2型糖尿病小鼠模型上通过检测小鼠血糖，观察肾组织HE染色形态，实时定量荧光PCR 分析肾组织血管内皮生长因子 PDX-1和insulin mRNA 等基因产物表达，Western blot检测小鼠肾脏IRS-1的表达，ELISA试剂盒检测小鼠血清胰岛受体和胰岛素受体底物-1含量。旨在探究 AdipoRon 对肾脏组织抗损作用的影响，为临床治疗 2 型糖尿病提供新的方案。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性C57/BL6小鼠40只，8～9周龄，购自上海史莱克公司。

1.1.2 实验试剂 AdipoRon(MCE)，链脲佐菌素(Sigma)，蛋白裂解液(碧云天)，逆转录试剂盒(诺维赞)，SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa)，PDX-1，insulin与actin引物(上海生工设计)。

1.1.3 实验仪器 血糖测试仪A-3型(三诺)，小型台式高速冷冻离心机(Thermo)，CFX Connect TM荧光定量PCR仪(Bio-Rad)。

1.2 方法

40只SPF级雄性C57/BL6小鼠，经适应性喂养1周后随机分为正常对照组(NC)(n=10)和实验组(n=30)。NC组喂养普通饲料，实验组喂养高糖高脂饲料。喂养35 d后，将小鼠禁食6 h，使用腹腔注射法注射40 mg/kg 1%链脲佐菌素，72 h后再禁食6 h，断尾取血测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，FBG>11.6 mmol/L且小鼠出现三多(多饮、多食、多尿)症状，则成功构建糖尿病小鼠模型。NC组腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲液。 建模成功后，将模型小鼠随机分为3组(n=10)：模型对照(DM)组、低剂量AdipoRon治疗(DM+L)组、高剂量AdipoRon治疗(DM+H)组。

使用去离子水溶解AdipoRon，DM+L组小鼠灌胃20 mg/kg·d AdipoRon，DM+H组小鼠灌胃50 mg/kg·d AdipoRon，NC、DM组则灌胃等量去离子水。10 d后，将小鼠禁食6 h，断尾取血测FBG。眼眶后静脉丛取血0.75 ml，静置过夜后离心取上清，保存于4℃。取各组肾脏标本并编号，部分组织使用4%多聚甲醛固定用于组织包埋，部分组织液氮速冻后保存于-80℃。ELISA试剂盒检测小鼠血胰岛素受体和胰岛素底物-1的含量。肾组织切片后进行HE染色，镜下观察并拍照各组肾脏组织形态。用Western blot方法检测小鼠肾脏p-IRS-1蛋白质的表达，使用Image I软件进行灰度分析，各组样本灰度值比上内参β-actin灰度值，再进行统计学分析。使用Trizol一步法提取小鼠肾组织总RNA，并测定RNA的浓度和纯度，然后使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，操作遵照试剂盒说明书，用实时荧光定量PCR测定肾组织胰岛素启动因子(PDX-1)和胰岛素(insulin)mRNA的表达，扩增结果以△CT值表示，各样本mRNA 表达结果以样本中β-actin的△Ct值为基准进行标准化计算，得到相对表达量，结果用2-△△Ct表示。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组血清中INSR、IRS-1、TNF-α的蛋白质含量以及血糖含量的比较

与正常对照组比较，DM组、DM+H组、DM+L组小鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)均升高，小鼠胰岛素受体(insulin receptor,INSR)和胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)的蛋白质含量均降低(P<0.05)；与DM组比较，DM+H组、DM+L组小鼠血糖和TNF-α下降，INSR和IRS-1 的蛋白质含量升高(P<0.05，表1)

Tab. 1 Serum levels of INSR, IRS-1, TNF-α and glucose in the four n=10)

NC: Normal control; DM: Diabetes model control; DM+L: Diabetes model control with low AdipoRon; DM+H: Diabetes model control with high AdipoRon; INSR: Insulin receptor; IRS-1: Insulin receptor substrate-1; TNF-α: Tumor necrosis factor-α

*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group

2.2 小鼠肾组织病理学变化

光镜下正常对照组小鼠肾小球外形饱满规则，肾小囊边界清晰，肾小管结构正常；模型对照组小鼠肾小球轻微肿大，内部充斥细胞炎症因子，肾小囊轻微肿胀；灌胃AdipoRon后，各剂量组小鼠肾小球和肾小囊病变较模型对照组明显减轻，炎症因子显著减少，肾小管组织空泡化减弱，其中高剂量组效果明显优于低剂量组，恢复接近正常(图1)。

Fig.1Changes of renal tissues in four groups(HE ×400)

NC: Normal control; DM: Diabetes model control; DM+L: Diabetes model control with low AdipoRon; DM+H: Diabetes model control with high AdipoRon

2.3 小鼠肾组织糖代谢相关基因表达变化

对小鼠肾脏PDX-1和insulin mRNA表达量检测结果显示，DM组小鼠PDX-1 mRNA相对表达量(0.08±0.02)较NC组小鼠(1.02±0.03)显著下降(P<0.01)，DM组小鼠Insulin mRNA的相对表达量(0.10±0.01)较NC组小鼠(1.04±0.04)也显著下降(P<0.01)。与DM组小鼠相比较，DM+H组小鼠PDX-1 mRNA相对表达量(0.51±0.08)和insulin mRNA的相对表达量(0.47±0.05)均显著上升(P<0.01)，DM+L组小鼠PDX-1 mRNA相对表达量(0.28±0.08)和Insulin mRNA的相对表达量 (0.12±0.03)也均显著上升(P<0.05，图2)。

Fig.2Comparison of PDX-1 and insulin expression in the tissues among the four groups

PDX-1: Pancreatic duodenal homebox-1

**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsDM group

2.4 小鼠胰岛素受体底物p-IRS-1蛋白质表达的变化

对小鼠肾脏p-IRS-1蛋白质的免疫印迹灰度值统计分析结果显示，DM组小鼠p-IRS-1灰度值(0.51±0.08)，与NC组小鼠(1.22±0.02)存在显著差异(P<0.01)，DM+H组小鼠p-IRS-1灰度值(0.95±0.09)较DM组小鼠(0.51±0.08)显著上升(P<0.05)，DM+L组小鼠p-IRS-1灰度值(0.65±0.03)与DM组小鼠(0.51±0.08)无显著差异(图3)。

Fig.3Comparison of p-IRS-1 expression in the tissues among the four groups

p-IRS-1: Phosphated insulin receptor substrate-1

**P<0.01vsNC group；#P<0.05vsDM group

3 讨论

2型糖尿病作为一种慢性代谢性疾病，胰岛素抵抗是其重要特征，表现为机体靶组织对胰岛素生理作用的敏感性降低，使得生理剂量的胰岛素产生低于正常的生理效应，机体为满足机体需要，代偿性分泌更多的胰岛素，产生高胰岛素血症，引起一系列病理生理的改变，诱导各种代谢性疾病的发生和发展[5，6]。AdipoRon作为一种新型的脂联素受体激动剂，通过与AdipoR1/2结合，激活AMPK通路，缓解胰岛素抵抗。日本东京大学的研究人员经过初步探讨认为50 mg/kg AdipoRon能够促进激活AMPK受体从而发挥其治疗作用[7]。本课题组前期细胞实验探索了更低剂量的 AdipoRon能增加细胞的耗糖量[8]，故设计低剂量药物组20 mg/kg和高剂量药物组50 mg/kg，选取高糖高脂饲料喂养并注射STZ诱导的2型糖尿病小鼠模型进行动物水平研究。给予AdipoRon灌胃治疗，观察2型糖尿病小鼠肾脏病理形态改变及肾组织部分蛋白质和基因的表达改变情况，进而探讨AdipoRon对2型糖尿病小鼠肾脏损伤的治疗作用。

研究报道[9]，2型糖尿病会对小鼠肾脏病理形态产生影响，本实验DM组小鼠肾小球轻微肿大；灌胃AdipoRon后，各剂量组小鼠肾小球病变较DM组有所减轻，其中高剂量组效果明显优于低剂量组，与正常组几乎无差异。提示AdipoRon对于2型糖尿病引起的肾组织损伤具有改善作用。

IRS-1是胰岛素受体的底物之一，IRS-1中丝氨酸的磷酸化对胰岛素抵抗的发生至关重要。文献报道[10]，IRS-1为一种信号转导蛋白，可用于调节胰岛素和IGF信号通路[11]，通过胰岛素与胰岛素受体结合而激活，发生自身磷酸化，生成它的活性形式p-IRS-1，从而激活PI3K/AKT通路，调节生长、代谢和下游存活PI3K，PI3K使机体内的葡萄糖发生改变[12]。有研究表明[13]，脂联素干预可以使2型糖尿病模型小鼠体内IRS-1酪氨酸磷酸化水平增加，促进胰岛素的信号转导、改善胰岛素抵抗。本课题中给药组小鼠INSR、IRS-1表达和p-IRS-1含量均显著上升，血糖降低。表明AdipoRon作为脂联素受体激动剂，作用于IRS-1，通过胰岛素与胰岛素受体结合，IRS-1磷酸化增强，使p-IRS-1含量上升，降低血糖，改善胰岛素抵抗。

近年来多有研究[14]，PDX-1(胰岛素启动因子)通过调控胰岛素及胰岛素相关基因表达,促进胰岛素分泌，维持胰岛β细胞的正常功能。研究报道[15]，当胰岛β细胞PDX-1 mRNA的表达增多，胰岛细胞功能得到改善，胰岛素抵抗情况得到改善，从而使机体内的葡萄糖含量降低。本实验结果提示，口服AdipoRon通过上调肾脏PDX-1和insulin mRNA的表达，对维持糖尿病小鼠胰岛β细胞正常功能有一定作用。

综上所述，本研究构建2型糖尿病小鼠模型，通过给予药物AdipoRon治疗，观察给药组和模型组小鼠肾脏中相关指标的变化。结果显示，AdipoRon对糖尿病小鼠肾脏组织损伤有一定的干预作用。