类风湿关节炎患者外周血白细胞介素-32的表达及临床意义

蔡培强，邵玉凯，李开雄，彭延刚

(1.四川省宜宾市第一人民医院 a.脊柱外科，b.屏山院区，四川 宜宾 644000；2.湖南省邵阳市中心医院风湿免疫科，湖南 邵阳 422000)

类风湿关节炎(RA)多发于中年女性的疾病，临床表现为慢性、进行性、对称性、多发性的关节炎，其病理改变为关节滑膜的慢性炎症、增生、血管翳形成，通过浸润型炎症、免疫细胞及成纤维样滑膜细胞之间的相互作用造成病理损害，病变可侵及关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等，从而导致关节软骨、骨和关节囊的破坏，严重时会导致关节畸形和功能丧失[1]。有研究指出，RA的患病率为0.5%～1.0%，80%以上的RA回出现中度以上残疾。RA的发病机制尚不明确，现主流认为免疫系统功能障碍是主要原因[2]。针对细胞因子指标的研究是目前的热点，白细胞介素-32(IL-32)是一种重要的具有免疫调节功能的细胞因子，但针对RA与IL-32相关性的研究比较缺乏，基于这一研究现状，本研究针对RA患者外周血IL-32的表达及临床意义进行分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2014年2月至2017年1月在医院风湿科住院或门诊就诊的152例RA患者，均符合美国风湿病学会1987年制订的RA诊断标准。根据患者活动积分(DAS28)分为高活动组(DAS28>5.1)55例、中低活动组(2.6≤DAS28≤5.1)52例和缓解期组(DAS28<2.6)45例；选取60例非RA结缔组织病患者作为非RA组，其中包括系统性红斑狼疮25例、强直性脊柱炎13例、皮肌炎7例、干燥综合症5例、系统性硬化4例、成人Still病4例；选取同期60例健康志愿者作为对照组。以上各组均排除合并心脑卒中、肝肾功能不全、糖尿病、恶性肿瘤、慢性阻塞性肺部疾病、炎症性肠病及入组时1个月内有明显急性感染性疾病症状者，妊娠期或哺乳期妇女。五组年龄、性别、体重等方面差异均无统计学意义(P> 0.05)。见表1。

表1 五组一般资料比较

1.2观察指标和检测方法采集各组研究对象的空腹静脉外周静脉血标本，取3 ml血样于室温下静置2小时后以3000 r/min的速度离心5 min后分离血清，置于-80 ℃冰箱中保存待测，应用酶联免疫吸附法(ELISA法)对血清中的IL-32和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平进行检测，ELISA试验盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，操作步骤严格按照使用说明书进行。取4 ml 血样经EDTA抗凝处理后，加入PBS和淋巴细胞分离液后以1500 r/min的速度离心15 min分离外周血单核细胞(PBMC)层，加入PBS再以1200 r/min的速度离心10 min后洗涤细胞两次，去上清加入总RNA提取剂充分溶解后置于-80 ℃冰箱中保存待测。应用总RNA提取剂提取总RNA后应用ReverTra Ace qPCR RT Kit合成cDNA，逆转录反应体系见表2，反应条件为37 ℃反应15 min，98 ℃反应5 min，反应产物置于-80 ℃冰箱中保存待测。应用实时定量聚合酶链式反应法(RT-PCR)对PBMC中的IL-32、TNF-α基因表达水平进行检测，目标RNA的引物序列及RT-PCR反应体系见表3、表4，反应条件为94 ℃预变性1 min，94 ℃变性15 s，56 ℃复性15 s，72 ℃延伸45 s，共反应40个循环，72 ℃延伸7 min，将反应产物于4 ℃下保存，IL-32、TNF-α基因的相对表达水平以2-ΔΔCt法表示。应用全自动物化仪(美国贝克曼库尔特公司生产)对RA患者的红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)等指标进行检测和分析。

表2 逆转录反应体系

表3 RT-PCR扩增反应体系

表4 目标RNA的引物序列

1.3统计学方法应用SPSS 22.0统计软件进行统计分析。计量资料比较采用方差分析及LSD法；相关性分析采用直线相关分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1五组PBMC中IL-32、TNF-αmRNA相对表达量的比较五组PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相对表达量差异均有统计学意义(F=9.126、16.336，P< 0.05)，其中，高活动组PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相对表达量显著高于其它四组，中低活动组PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相对表达量高于缓解期、非RA组和对照组(P< 0.05)，缓解期、非RA组和对照组PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相对表达量差异无统计学意义(P> 0.05)，见表5。

2.2五组血清IL-32、TNF-α水平比较五组血清IL-32、TNF-α水平差异均有统计学意义(F=69.038、78.156，P< 0.05)，其中，高活动组血清IL-32、TNF-α水平显著高于其它四组，中低活动组血清IL-32、TNF-α水平高于缓解期、非RA组和对照组，非RA组血清TNF-α水平高于缓解期组和对照组(P< 0.05)，缓解期、非RA组和对照组血清IL-32水平差异无统计学意义(P> 0.05)，缓解期组和对照组血清TNF-α水平差异无统计学意义(P> 0.05)，见表6。

表5 五组PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相对表达量(2-ΔΔCt)比较 (pg/ml)

a与高活动组比较，P< 0.05；b与中低活动组比较，P< 0.05；c与缓解期组比较，P< 0.05；d与非RA组比较，P< 0.05；e与对照组比较，P< 0.05

表6 五组血清IL-32、TNF-α水平比较 (pg/ml)

a与高活动组比较，P< 0.05；b与中低活动组比较，P< 0.05；c与缓解期组比较，P< 0.05；d与非RA组比较，P< 0.05；e与对照组比较，P< 0.05

2.3RA患者血清和PBMC中IL-32、TNF-α水平与病情指标的相关性分析RA患者血清和PBMC中的IL-32、TNF-α水平与DAS28评分、ESR、CRP、RF等病情指标均具有相关性(P< 0.05)，见表7。

表7 RA患者血清和PBMC中IL-32、TNF-α水平与病情指标的相关性分析

3 讨论

RA的诱因与免疫细胞、细胞因子、免疫活性物质等多种系统相关，机理复杂。有研究表明，RA患者存在着Th1/Th2细胞功能、Th17/Treg细胞功能的失衡和B细胞功能亢进，这又导致了TNF-α、干扰素(IFN)和白细胞介素等细胞因子的异常表达，最终成为滑膜损害、血管翳增生、破骨细胞生成、滑膜新生血管生成、骨及软骨侵蚀等RA病理改变的重要机制[3～6]。其中白细胞介素是最重要的细胞因子，研究表明IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-17、IL-23、IL-35、IL-37等在RA病情发展中有重要作用[7～10]，针对白细胞介素与RA病理过程的相关性研究已成为热点领域。

本研究结果显示，RA患者的血清和PBMC中的IL-32水平均呈现出显著的升高，且和活动性呈正相关，外周血IL-32水平与病情严重水平有一定相关性，表明IL-32在RA的进展和活动性增强过程中具有重要的作用，外周血IL-32水平可作为评价RA病情的辅助指标。IL-32是一种前炎症反应细胞因子，主要功能是诱导TNF-α、IL-1β、IL-6、核因子、促分裂原活化蛋白激酶和趋化因子的产生和释放，在炎症反应中有不可替代的作用[11]。IL-32主要存在于NK细胞、T细胞、上皮细胞及PBMC中，可诱导形成炎症级联式反应、促进细胞凋亡、诱导细胞分化，对固有性和适应性免疫应答发挥调节作用[12]。相关研究结果显示，IL-32的异常表达与病原体感染、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病、肺结核、肝炎、炎症性肠病、恶性肿瘤等疾病具有密切的相关性，而且瘢痕组织成纤维细胞中在存在着明显的IL-32基因缺失，故IL-32还与成纤维细胞过度增生、胶原减少、细胞外基质过度沉积等病理过程有关[13]。在近年来的研究中，高利常等[14]和桂明等[15]的研究均证实了，在RA患者中可观察到血清和PBMC中IL-32表达水平的升高，而且其水平与RA的病情严重和骨质破坏程度等均具有相关性，这提示了IL-32可作为反映RA活动度的辅助指标，但这些研究均存在着样本量较小的缺陷，本研究同样存在这一问题，还需要大样本、多中心、设计良好的临床研究予以研究和讨论。

综上所述，RA患者表现为外周血IL-32水平的显著升高，其水平与其疾病严重程度和活动性程度指标具有相关性，提示了IL-32可能在RA的活动性增强过程中具有重要的作用，可作为评价RA病情的辅助指标。

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