再生障碍性贫血患者免疫抑制治疗前后外周血VEGF、TNF-α和IFN-γ表达变化及临床意义

李敬东，韩效林，杨 翠，孙 玲

(1.新乡医学院第一附属医院血液科，河南 新乡 453100；2.郑州大学第一附属医院血液科，河南 郑州 450052)

再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)是指骨髓未能生产足够或新的细胞来补充血液细胞的情况[1]。AA患者三种血液细胞(红细胞、白细胞及血小板)均出现降低情况[2，3]。有研究表明，AA的发生及发展与骨髓中造血干细胞的免疫性损伤有紧密关系，其自身免疫反应会被不同的刺激物激活，从而释放出如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)、血管内皮生长因子(VEGF)等造血负调控细胞因子[4]，造成造血干细胞分裂受阻而凋亡，临床上有关淋巴细胞浆内表达甚少[5，6]，为此本研究运用流式细胞术检查接受免疫抑制治疗前后的AA患者，进行外周血VEGF、TNF-α和IFN-γ表达变化及临床意义分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料两院2012年1月至2014年4月收治的30例AA初发患者设为对照组，2014年5月至2016年4月收治的30例经免疫抑制治疗后的AA患者设为观察组。纳入标准：①均经临床症状及外周血象、骨髓涂片及活检确诊；②均符合AA诊断及疗效标准；③年龄11～62岁；④患者及家属均知情且自愿同意签字。排除标准：①有相关药物过敏史；②除免疫抑制剂外还有特殊用药史；③有未按要求服用规定药物而影响疗效判断；④自身免疫性疾病；⑤有其他严重并发症；⑥同一时间段已参加其他相关研究。观察组男13例，女17例，年龄14～59岁[(28.76±4.53)岁]；对照组男14例，女16例，年龄15～61岁[(28.63±4.27)岁]。两组基线资料比较差异无统计学意义(P> 0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准同意执行。

1.2检查方法治疗前后分别抽取两组患者外周静脉血3 ml(肝素抗凝管)，检测T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)、NKT细胞及NK细胞的百分比，流式细胞仪型号EPICS®ALTRATM(美国贝克曼库尔特有限公司)。使用肝素钠充分抗凝并立即检测，利用佛波酯及离子霉素联合刺激淋巴细胞，并采用莫能霉素抑制高尔基体，通过胞内抗体标记来检测胞浆内细胞因子表达水平，每份标本处理方式为：500 U肝素抗凝血+500 U 1640培养液(含10%胎牛血清)+PMA(50 ng/ml)+离子霉素(1 ng/ml)+莫能菌素(1.7 ng/ml)，孵育时间5小时，温度37 ℃和5%CO2。刺激完成后标记CD3-APC，室温避光孵育30分钟并用PBS洗涤后1%多聚甲醛固定，上机检测。以流式细胞仪收集2×105个细胞，以CD3设们测定CD3阳性细胞的胞浆内TNF-α和IFN-γ的表达百分率，每份标本同时进行同型对照的检测。VEGF的表达检测：采用原位杂交法。两组标本用固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(pH 7.2～7.6)室温固定30分钟蒸馏水充分洗涤，干燥后20 ℃保存。30%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37 ℃消化5～120秒。原位杂交PBS洗3次×5分钟蒸馏水洗1次。后固定：固定液为1%多聚甲醛0.1 M PBS(pH 7.2～7.6)，室温固定10分钟，蒸馏水洗3次。预杂交：每张片子加20 U杂交液，放置专门盖玻片，恒温箱38～42 ℃杂交过夜。杂交后洗涤：不同浓度SSC液洗涤。滴加封闭液：37 ℃30分钟甩去多余液体，不洗，依次滴加生物素化鼠抗地高辛(37 ℃、60分钟)、SABC(37 ℃、20分钟)、生物素化过氧化酶(37 ℃、20分钟)，每次加药前均用PBS洗5分钟×4次。DAB显色：使用DAB显色试剂盒，1 m蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，加至标本。显色20～30分钟充分水洗。必要时苏木素复染，充分水洗后观察。利用高清晰度彩色病理图文报告分析系统，先于低倍镜下全面观察，VEGF阳性呈棕黄色颗粒状，主要位于细胞质。随机观察5个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞百分率，取其平均值。

1.3观察指标测定T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)、NKT细胞及NK细胞的百分比及CD3+淋巴细胞胞浆内TNF-α和IFN-γ，并比较两组治疗前后相同部位骨髓涂片标本中VEGF表达水平。

1.4统计学方法采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料比较采用卡方检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组免疫细胞变化情况比较治疗后，观察组T淋巴细胞亚群及NK细胞改善明显优于对照组(P< 0.05)，见表1。

表1 两组免疫细胞变化情况比较 (%)

b与对照组比较，P< 0.05。

2.2两组TNF-α、IFN-γ和VEGF表达比较治疗后，观察组CD3+/TNF-α+(%)、CD3+/IFN-γ+(%)和VEGF表达较对照组明显下调(P< 0.05)，见表2。

表2 两组TNF-α、IFN-γ和VEGF表达比较

a与对照组比较，P< 0.05

3 讨论

AA是由多种因素引起的骨髓造血干细胞、造血微环境及机体免疫调节能力改变，导致骨髓造血干细胞减少、造血功能衰竭，出现以全血细胞减少、进行性贫血、出血、反复感染为主要临床表现的综合征[7]，AA的发病机制复杂，其中免骨髓造血微环境损伤为其机制之一，故学者多以免疫介导造血抑制方面做研究[8，9]。其各种细胞因子及细胞之间的相互调节为造血的免疫调节因素[10]，而部分AA患者存在细胞因子调节机制的异常，有研究认为[11，12]其异常可能介入造血干细胞的增殖和分化紊乱。而自身反应性T淋巴细胞被不同的刺激物激活而分泌的骨髓抑制性细胞因子有TNF-α和IFN-γ、IL-2，其中TNF-α和IFN-γ是最重要的造血负调控因子。有研究报道[13，14]，在体外造血抑制实验中，TNF-α和IFN-γ能有效的抑制爆式红细胞集落形成单位(BFU-E)的形成且AA患者IFN-γ的mRNA的检出率显著增高。但有关AA患者在临床上有关淋巴细胞浆内表达甚少。结合本研究显示，AA患者外周血淋巴细胞胞浆内TNF-α和IFN-γ的表达显著高于对照组，证实AA患者有造血调控相关的细胞因子平衡失调，造血负调控因子表达相应增加，同国外学者观点一致[15]。目前，临床上主张采用免疫抑制治疗AA患者，尤其是无骨髓移植适应指征的AA患者，其有效率高达75%。结合本研究结果，在治疗后，观察组CD3+/TNF-α+(%)和CD3+/IFN-γ+(%)、VEGF的表达较对照组明显下调。我们认为治疗后AA患者体内T细胞的功能受到了抑制，造血负调控因子表达的水平降低，从而有助于骨髓造血功能的恢复和重建。

研究AA患者和经免疫抑制治疗后患者的CD3+T淋巴细胞胞浆内TNF-α和IFN-γ的表达改变，可为免疫抑制治疗疗效观察提供早期的实验依据。有学者研究认为流式细胞术比运用ELISA法直接检测血浆中TNF-α和IFN-γ浓度更具有细胞特异性，能客观地检测患者体内特异性T细胞分泌细胞因子的瞬时变化情况，因而更能反映免疫抑制药物作用后的T淋巴细胞功能改变[16，17]。流式细胞术有可能成为再生障碍性贫血患者免疫抑制治疗疗效的检测和早期预测指标之一[18]。而VEGF是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生，是属于血小板源性生长因子，也是一种高度特异的血管内皮细胞分裂原[19，20]。VEGF在临床上能在维持正常血管密度方面发挥积极作用且与生理性造血密切相关，而T淋巴细胞亚群属于人体免疫系统的重要组成部分，一般肿瘤患者的免疫力低下多表现为CD4+T细胞减少、CD8+T细胞增加、CD4+/CD8+比值(表示机体的免疫状态)下降；NKT细胞属于另外一类T细胞，在机体中重要的抗感染及抗肿瘤免疫等方面有的作用，NK细胞属于机体重要的非特异免疫细胞。结合本研究观察组VEGF水平明显低于对照组，治疗后明显高于治疗前，提示VEGF分泌减少与AA的发生或进展有关。我们认为损伤造血微环境，导致正常的血管密度难以维持，骨髓血管生成减少，造血基质改变，血管通透性降低，骨髓局部血供、氧供减少，骨髓脂肪化加速，造血组织萎缩，从而影响生理性造血。VEGF维持造血干细胞的生存、分化和发育功能直接受影响，故VEGF在AA患者中呈低表达，其可从多方面影响骨髓血管生成和造血干细胞的生存，在AA发病机制中的具体作用有待进一步研究。

综上所述，AA患者经免疫抑制治疗后可有效的减少胞浆内的TNF-α和IFN-γ的表达，且AA患者中VEGF呈现低表达现象。

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