羟氯喹对MBL/lpr狼疮鼠激素性股骨头坏死的影响

李洁，张乾坤，金烈

（丽水市中心医院，浙江 丽水 323000）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）好发于育龄期女性，通常需终生服用糖皮质激素（以下简称“激素”）控制病情。长期和/或大剂量的激素使用会导致一系列的严重并发症，如感染、骨质疏松、股骨头坏死等，其中SLE股骨头坏死的发生率约5%～10%[1]。由于SLE患者以青年女性多见，一旦发生股骨头坏死，致残率极高，给患者带来社会、经济、心理上的多重压力。羟氯喹是SLE的基础用药，除免疫抑制作用外，根据其抗凝、抗血小板及降脂的作用，长期服用可显著降低心血管事件的发生率[2]，部分回顾性研究发现，羟氯喹对股骨头坏死亦有保护作用[3-4]。本研究主要评价羟氯喹对MBL/lpr狼疮鼠激素性股骨头坏死的保护性作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 16周龄MBL/lpr雌性狼疮鼠，体质量36～38g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SYXK（沪）2017-0008，饲养在温州医科大学动物实验中心清洁级（SPF）动物房中。实验药物：羟氯喹购自上海上药中西制药有限公司 （100mg×14片），批号：H20123414；甲强龙针购自美国辉瑞制药有限公司（40mg/支），批号：H20080284。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药 将全部小鼠随机分为3组，即对照组、模型组和羟氯喹组，每各10只，其中对照组不予造模和给药，模型组参与造模但不给药，羟氯喹组于造模成功后当天给予口服羟氯喹 （10mg/kg，化入水中）1次/d，模型组及对照组每天饮同等量水。

1.2.2 造模 造模动物自由进食与饮水，每天试纸条法测尿蛋白，如出现尿蛋白“+”以上结合血抗双链-DNA抗体阳性则认为狼疮发病，当天即开始造模。予脂多糖（LPS）10μg/kg腹腔注射，24小时后予甲强龙20mg/kg肌肉注射3次 （每次间隔24小时），同时造模当天起口服复方磺胺甲恶唑片（40mg/kg，溶解于水），隔天1次，以预防感染。

1.3 标本收集和检测 自造模开始第1天为第1周起始时间，于第8周末处死所有小鼠，处死前24小时起留取24小时尿，处死后取血标本和双侧股骨头标本做进一步的研究。

1.3.1 血、尿标本的采集和分析 （1）10%水合氯醛腹腔注射麻醉后针刺心脏采血，于-20℃冰箱中保存，待测各项指标。反应凝血功能的指标凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血酶原时间（APTT）及反应血脂的指标总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）的测定采用相应自动化检测仪；反应内皮细胞损伤的指标一氧化氮（NO）的测定采用硝酸还原酶法。（2）动物处死前1天用代谢笼收集24小时尿量，在收集容器中放入少量甲醛溶液，离心后保存于-20℃冰箱中，待测24小时尿蛋白。采用考马斯亮蓝法测定尿蛋白浓度，计算24小时尿蛋白定量，24小时尿蛋白定量=尿蛋白浓度×24小时尿量。

1.3.2 股骨头病理组织学分析 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速取出双侧股骨头，DEPC水配制的PBS溶液冲洗后，置于体积分数为10%的多聚甲醛溶液固定，用于病理检查。股骨头固定24小时后，10%EDTA脱钙，系列酒精脱水，石蜡包埋，常规切片，厚约5μm。每个标本取两张切片，切片间隔约100μm，常规HE染色。在光学显微镜下观察切片，并计算各项指标。（1）股坏死的定义[5]：两张切片至少有一个坏死病灶则定义为骨坏死阳性，检查部位均未发现坏死病灶则定义为骨坏死阴性。（2）空骨陷窝率计算[5]：每张切片以股骨头软骨下区为中心，上下左右随机选取4个视野，每个视野内计数空骨陷窝数（K），再计数总骨陷窝数（T），空骨陷窝率=（K/T）×100%，将4个数值的平均数作为该切片的空骨陷窝率。两张切片的平均值作为该标本的空骨陷窝率。

1.4 统计学处理 统计分析用SPSS16.0软件，所有计量资料以（±s）表示，计数资料以中位数或百分率表示，组间差异采用方差分析或χ2检验。

2 结果

2.1 实验室指标 至第8周末，对照组、模型组、羟氯喹组各有9、7、8只小鼠存活。模型组与对照组比较，模型组小鼠PT、APTT较对照组明显缩短，而模型组小鼠的TC、NO含量较对照组明显升高，差异均有统计学意义 （均P＜0.05）。比较模型组与羟氯喹组，羟氯喹组PT、APTT明显加长，TC、NO含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

2.2 股骨头病理组织学分析

表1 三组实验室指标比较（±s）

表1 三组实验室指标比较（±s）

与对照组比较#P＜0.05，与模型组比较*P＜0.05

2.2±0.6 1.9±0.7羟氯喹组 8 1 2.2±0.3*4 1.2±6.8*1.3±0.5 3.8±1.1*1 5.2±3.7*2.1±0.3 2 4小时尿蛋白（g）对照组模型组组别 n P T（s）A P T T（s）T G（m m o l/L）T C（m m o l/L）N O（n m o l/L）9 7 1 2.1±0.3 1 1.2±0.4#3 7.5±7.4 3 2.7±8.6#1.5±0.4 1.8±0.6 4.9±1.2 6.5±1.3#2 3.4±6.4 3 0.4±5.4#

2.2.1 大体表现 对照组股骨头大多外观形态正常，关节软骨面光滑、平整，软骨色泽红润；模型组大多出现局部关节软骨面粗糙，可见散在出血点及大片瘀斑，关节面呈灰白色，骨质硬度下降，脆性增加，易于凿取；羟氯喹组病变程度虽然较对照组加重，但较模型组明显减轻。

2.2.2 镜下表现 对照组骨小梁完整，排列规则，骨小梁中的骨细胞清晰可见，空骨陷窝少见，造血细胞丰富，脂肪细胞相对较少，形态正常；骨髓腔内血管分布均匀，未见血管出血（图1A）。模型组骨小梁结构紊乱，广泛地骨小梁断裂、稀疏、纤细，可见大量的空骨陷窝；骨髓腔内脂肪细胞增多、增大明显，并出现脂肪细胞互相融合，造血细胞减少明显（图1B）；羟氯喹组病变程度较模型组减轻 （图1C）。模型组股骨头坏死发生率较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；羟氯喹组与模型组在股骨头坏死率方面差异无统计学意义 （P＞0.05）。在空骨陷窝率方面，模型组较对照组明显增加，羟氯喹组较模型组明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 详见表 2。

表2 三组股骨头坏死及空骨陷窝率比较

3 讨论

股骨头坏死分为创伤性和非创伤性，其中激素性股骨头坏死是非创伤性股骨头坏死的首要成因。其确切的发病机制仍不清楚，目前有多种假说，包括血管内凝血学说、血脂代谢紊乱学说、内皮细胞损伤学说、细胞凋亡学说、骨质疏松学说等[6]。既往研究表明，SLE发生股骨头坏死的最主要危险因素是大剂量激素的使用，特别是接受过激素冲击治疗者[2-3]。且SLE较其他疾病股骨头坏死率升高，来自日本的一项大规模的流行病学调查发现[7]，激素性股骨头坏死的患者中31.2%为SLE，排名第二的肾病综合征仅6.3%。这可能是与SLE体内存在补体激活产物、免疫复合物、细胞因子、抗磷脂抗体等物质，导致血管内皮细胞受损，导致的明显血栓形成倾向有关[8]。而激素的大剂量使用能使血管内皮细胞损伤及血管内高凝状态进一步加重，大大增加了股骨头坏死的风险。

图1 小鼠股骨软骨微形态变化。1A：对照组髓腔内血管分布均匀，未见血管出血；1B：模型组骨髓腔内脂肪细胞增多、增大明显，并出现脂肪细胞互相融合，造血细胞减少明显；1C：羟氯喹组髓腔内脂肪细胞较模型组减少，造血细胞轻度减少。

羟氯喹是一种抗疟药，通过弱化抗原表达和递呈、抑制细胞介导的细胞毒作用、抑制IL-1等炎症因子释放、降低循环免疫复合物等机制，发挥抗炎和免疫调节作用，现被广泛用于风湿性疾病的治疗，如SLE、类风湿关节炎、干燥综合征、抗磷脂抗体综合征等。此外，在使用羟氯喹抗风湿治疗的同时发现其相关作用[2，9]：（1）可一定程度抗血小板聚集，存在抗凝抗血栓的作用；（2）具有很好的脂代谢调节作用，能降低总胆固醇、甘油三酯、极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白，对于接受激素治疗的患者该作用明显；（3）具有抗动脉粥样硬化作用，通过对抗血管炎症和抗氧化，从而减少血管内皮细胞功能紊乱，预防动脉粥样硬化的形成。本研究结果显示，SLE股骨头坏死小鼠服用羟氯喹后，PT、APTT较模型组明显延长，TC以及血NO明显降低，且股骨头空骨陷窝率有明显的减小（均P＜0.05），证实了羟氯喹对激素性股骨头坏死的SLE小鼠有抗凝血、降脂和抗炎作用。在一项SLE患者股骨头坏死危险因素的回顾性研究中发现，羟氯喹是股骨头坏死保护因素[3-4]。

有狼疮背景的MBL/lpr小鼠建立激素性股骨头坏死给予羟氯喹干预，发现羟氯喹可显著改善激素性股骨头坏死的发生，这种预防作用很可能是通过改善高凝状态、内皮细胞功能紊乱、血脂代谢异常等实现的，确切的机制仍需进一步研究。