口腔成纤维细胞生长因子FGF-1对PCNA蛋白及糖尿病颌下腺功能退化的影响

钟翠翠 张义喜 陈桂英

糖尿病是长期危害人类健康的常见慢性病之一，患者长期的体内水分流失形成多饮、口干等临床症状，由于长期大量饮水和唾液分泌常导致唾液流速加快、唾液内免疫蛋白成分平衡紊乱等现象，长期发展会并发唾液腺功能障碍[1-2]。下颌下腺不仅能分泌唾液，其腺体和导管上皮细胞内含有多种能表达生物活性的物质，同时此类细胞凋亡和增殖的消长可影响腺体分泌功能和组织结构[3]。增殖核细胞抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是存在于正常增殖细胞或肿瘤细胞内的DNA结合因子，可显著影响细胞增殖、凋亡[4-5]。成纤维细胞生长因子1(fibroblast grow th factor 1，FGF-1)是成纤维细胞生长因子家族的重要成员，有较强的促增殖作用，能刺激血管生长、加速创伤愈合以及促进神经损伤修复[6]。随着医药研究的深入发现，FGF-1对糖尿病及其并发症，如糖尿病性口干等的治疗效果较为显著，但是对于FGF-1作用于糖尿病颌下腺组织的作用机制尚无详细报道[7]。本项研究通过对FGF-1干预糖尿病患者治疗后小鼠临床指标和颌下腺PCNA功能变化进行观察，获得了较为显著的结果，现汇报如下。

1.材料与方法

1.1 仪器和药品 药物和试剂FGF-1注射液(1000mg/L，纯度＞97%。上海高创化学科技有限公司提供，批号17071102)；血糖仪和血糖试纸(上海罗氏诊断产品有限公司)；HE试剂盒(北京索莱宝生物科技公司)；兔抗鼠PCNA一抗和山羊抗兔二抗(sc-2016，Santa Cruz，美国)；生物组织石蜡包埋机(Leica公司，德国)；石蜡切片机(Leica公司，德国)；电子天平(上海天平仪器厂)；超净工作台(Thermo公司，美国)；光学显微镜(日本Olympus公司BX50型)；离心机(Beckman公司，美国)；-20℃、-80℃冰箱(Thermo公司，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物来源 2型糖尿病雄性C57BL/6 db/db(糖尿病模型小鼠)小鼠20只，体重18-22g，7-9周。血糖＞18.0mmol/L，全部来自于阳谷县人民医院实验动物生命科学研究组(具有动物培养合格证)。另选10只8周龄的雄性db/m(非糖尿病模型小鼠)小鼠作为对照组。

1.2.2 动物分组方法 对照组小鼠不做处理，正常喂养。随机数字表法将20只db/db小鼠平均分为2组，模型组、实验组(FGF-1组)，每组10只。3组小鼠各项指标组间比较无显著统计学差异(P＞0.05)。实验组小鼠按照2 mg/kg的比例腹腔给药FGF-1注射液，2次/d，持续给药观察16周。模型和对照组小鼠按照同等剂量的生理盐水，以同样腹腔给药的方式对小鼠进行注射。本研究所有小鼠饲养均选择动物实验中心环境，喂养普通饲料，饮水和喂食均无特殊要求[8]。

1.2.3 基础指标检测 观察血糖和体重指标水平，从给药观察开始，每周第七日定时随机选取每组小鼠采用电子天平称量体重并准确登记。血糖检测后取小鼠断尾后血样，血糖测定仪校准检测血糖值。

1.2.4 唾液流率检测 从给药观察开始，每周第七日定时进行唾液流率检测。根据小鼠体重计算小鼠麻醉剂量，腹腔给药10%水合氯醛4m/kg，0.1%毛果芸香碱0.5mg/kg，等待20min后进行唾液收集。唾液收集取小鼠坐立位，头向下，将称量干棉球置于小鼠下颌下腺导管开口处，维持状态15min后称重记录。唾液流率采用棉球吸收唾液后质量减去干棉球质量与小鼠体重的比率计算。

1.2.5 HE染色观察病理 16周，取小鼠进行水合氯醛麻醉，开胸腔，入左心室到主动脉部，开右心耳。生理盐水冲洗后多聚甲醛灌注固定，取颌下腺组织，固定24h，乙醇浓度梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，连续切片5μm，进行HE染色并观察，采用数码显微镜观察小鼠颌下腺腺泡和组织情况并拍照，观察颌下腺、黏膜充血、腺体分泌、黏膜充血以及水肿等情况[9]。

1.2.6免疫组织化学染色检测各组小鼠颌下腺组织中PCNA的表达[10]石蜡切片常规脱蜡，用3%双氧水-甲醇溶液浸泡，室温避光孵育20min，0.01%枸橼酸缓冲液高压锅内加热煮沸2min，抗原修复。分离抗原修复盒，25℃静置45min，滴加1%山羊血清35μl，于37℃恒温箱湿盒内孵育30min；用枸橼酸缓冲溶液洗涤2次后，滴加兔抗鼠PCNA一抗(1∶150)，4℃过夜孵育；用枸橼酸缓冲溶液洗涤2次后，滴加标记过的山羊抗兔二抗(1∶150)，37℃温箱湿盒内孵育1h；DAB显色，苏木素复染、脱水、封片。光镜观察免疫组化染色切片，其中PCNA阳性表达细胞内可见棕黄色粗颗粒或棕黄色细颗粒分布。分别从三组选取相同数目的切片且切片清晰不重叠。计算视野的可见显色数目，计算细胞阳性率：细胞阳性率=阳性细胞数÷视野内细胞总数×100%。

1.3 统计学方法 本研究采用统计学软件SPSS 20.0进行统计学处理，计量资料采用(x±s)表示，进行t检验分析，设P＜0.05时差异有统计学意义，具有可比性。

2.结果

2.1 基础指标检测 通过对小鼠体重和血糖检测指标可知，实验组小鼠体重水平从监测第4周开始有显著下降(P＜0.01)，与同期模型组相比均显著较低(P＜0.01)。实验组小鼠血糖水平从监测第1周开始有显著下降(P＜0.01)，与同期模型组相比下降有显著差异(P＜0.01)，从第四周开始，实验组与对照组相比，无显著统计学差异(P＞0.05)。具体检测结果如图1所示：

图1 基础指标检测小鼠体重和血糖

2.2 唾液流率检测比较 实验期间实验组小鼠唾液流率呈递增趋势，且在实验8和16周时唾液流率均显著高于同时间点模型组(P＜0.05)，但仍均显著低于同时间点空白对照组(P＜0.05),如表1所示。

表1 三组小鼠唾液流率对比(mg/(min·kg)，x±s，n=10)

2.3 HE染色观察颌下腺病理情况 HE染色结果如图2显示：实验组小鼠颌下腺组组织结构清晰，未见明显病变，腺泡或导管萎缩程度与模型组相比显著减轻；模型组病变严重，腺泡间隔增厚，实验组纤维化病变情况较模型组轻。对照组小鼠下颌下腺组织腺泡饱满、腺泡间边界清晰；腺泡细胞呈锥体形且排列密集，细胞质染色较浅，细胞核呈圆形，靠近细胞基底部；导管组织中，颗粒曲管较多，管腔较大，管壁由单层柱状上皮细胞围成，排列整齐，细胞顶部胞质中含大量嗜酸性颗粒。模型组小鼠下颌下腺组织腺泡明显萎缩，腺泡细胞排列紊乱；导管组织中，颗粒曲管数目减少，管径变细，有的甚至失去管腔结构，导管细胞排列呈簇状堆集，细胞顶部胞质中分泌颗粒嗜酸性减弱。

图2 颌下腺腺泡和导管HE染色(光镜×400)

2.4免疫组织化学检测 实验结果显示，3组小鼠颌下腺腺泡细胞及导管细胞中均有PCNA存在，尤以颗粒曲管中表达最强，阳性反应物质主要位于腺泡细胞及导管细胞细胞核内。对照组、模型组和实验组小鼠下颌下腺PCNA细胞阳性率依次是(45.23±7.78)、(11.50±1.69)%、(36.98±6.53)%，组间差异有显著统计学意义(均P＜0.05)，如图3所示。

图3 免疫组织化学检测颌下腺PCNA抗原的表达(光镜×400倍放大)

3.讨论

糖尿病是全球最主要的一种以全身性代谢紊乱为主慢性内分泌性疾病，随着病情的发展神经、脑、眼、心、肾等各部分器官并发症和功能障碍尤其严重，对患者生活造成很大不良影响，形成了大规模的社会、医疗、家庭等规模性的发展障碍[11-12]。多饮口干是糖尿病患者主要表现，主要是因为糖尿病患者血糖导致血液渗透压升高，肾渗透性成尿增多，血容量减少，传导大脑皮层饥渴反应，形成多饮口干表征[13-14]。长期口干和饮水会激发口腔唾液分泌和唾液腺组织功能损伤，糖尿病患者口腔唾液腺体比正常人负担重，其中颌下腺功能退化是显著表现之一[15-16]。长期唾液分泌工作下，糖尿病患者颌下腺、腮腺等腺体疲劳，尤其腺体积缩小，导致腺体唾液流率降低，影响组织和导管营养平衡，导致蛋白质、脂质体、糖分等的代谢失调，使唾液成分和分泌异常。

FGF-1是近年来糖尿病治疗药物应用和关注较多的优势因子[17]，具有可取代胰岛素调节血糖的治疗地位。有关胰岛素降糖小鼠实验研究曾经报道，胰岛素降糖过程对颌下腺细胞增殖和结构变化均有影响。通过这个结果考虑FGF-1在颌下腺细胞核增殖结构中的作用，研究其在小鼠降糖过程中的基础指标变化。本研究结果显示，实验组小鼠在体重和血糖水平方面均有显著改善，减肥和降糖趋势均有持续下降到平稳发展。可见在糖尿病治疗上FGF-1已经有了可以与胰岛素相比的药理意义。

试验中通过对小鼠颌下腺病理观察发现，糖尿病小鼠颌下腺萎缩明显，组织学亦观察到下颌下腺腺泡明显萎缩，细胞排列紊乱；颗粒曲管导管数目减少，管径变细[18-19]。FGF-1介入治疗的糖尿病小鼠下颌下腺腺体及组织学形态经过16周的维持观察均逐渐趋于平稳。可见FGF-1对逆转糖尿病型颌下腺功能不良作用。唾液流率检测结果中，FGF-1介入治疗的糖尿病小鼠唾液流率随着时间延长而逐步增加，提示FGF-1也可逆转糖尿病导致的下颌下腺功能损伤[20]。糖尿病使颌下腺萎缩的病理机制可能与氧化应激及细胞凋亡相关。氧化应激是糖尿病及其并发症发生发展的关键因素[21]。长期高血糖环境使颌下腺组织中活性氧产生增加，而抗氧化物质不足，机体对氧自由基的清除能力大大减弱，这种动态失衡引起活性氧有害蓄积，对细胞内蛋白质、核酸和脂质等大分子物质造成氧化损伤，从而导致细胞凋亡[22]。

通过本研究对糖尿病小鼠下颌下腺PCNA免疫组织化学检测表达可知，糖尿病小鼠颌下腺细胞PCNA细胞阳性率显著下降，而FGF-1给药组小鼠细胞阳性率显著高于糖尿病小鼠的细胞表达。这说明糖尿病发病时小鼠颌下腺腺泡和导管活跃度降低，腺体功能减弱。而FGF-1因子的介入使颌下腺PCNA含量显著增加，直接产生颌下腺腺体增殖功能加强[23]。FGF-1可通过调节血糖缓解氧化应激反应活化磷酸肌醇3激酶和P38靶点，促进分裂原活化蛋白激酶信号通路[24]。与其他类型癌细胞株比较，P38信号通路的的激活可促进AKT、PI3K、mTOR及胞外信号调节激酶P38 MAPK等磷酸化。这是细胞内外信号传导和刺激诱发PCNA细胞表达的直接作用，对增强细胞分裂和增殖具有作用要意义[25]。

4.结论

通过本研究可知，口腔FGF-1可产生与胰岛素相比的降糖效果，对调节机体营养代谢和唾液分泌能力具有显著疗效。同时可通过调节PCNA的表达实现对糖尿病小鼠颌下腺结构萎缩功能退化的逆转效果。

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