凤丹籽油对肝癌HepG2细胞抑制作用的研究

李梅青 周 鑫 王增蕾

(安徽农业大学茶与食品科技学院1，合肥 230036)

(合肥农产品加工研究院2，合肥 230036)

凤丹(PaeoniaostiiT.HongetJ.X.Zhang)，因主要产于安徽省铜陵凤凰山和南陵西山一带，其具有根粗、粉足、肉厚、木心细、久贮不变质且根皮含丹皮酚等多种生物活性物质的特点，被称为凤丹。2011年3月，国家卫生部批准牡丹籽油为新资源食品。目前，能榨油的牡丹籽只有2种：凤丹、紫斑牡丹。前期对牡丹籽油的研究，大多集中在产自洛阳、菏泽的一些牡丹品种，研究主要为脂肪酸组成、抗氧化、抑菌等。研究发现，采用GC/MS分析牡丹籽油，不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的86.52%～92.00%，其中亚麻酸占37.4%～54.81%，亚油酸占23.26%～33.34%[2-5]。亚麻酸及亚油酸具有降血脂[6-7]、预防心血管疾病[8-9]、抗肿瘤[10]等多种重要生理功能，是营养和保健功能的重要物质基础。近期试验研究显示[11]膳食补充食品功能性脂质多不饱和脂肪酸能够预防和改善多种炎症和肿瘤疾病，并且对正常细胞和组织几乎不会造成损伤。

肝癌是病死率最高的恶性肿瘤之一。我国每年约有38.3万人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例数的51%[12-13]，因此有效预防肝癌的发生具有重大意义。由于不同类型以及同类型不同结构的不饱和脂肪酸，对肿瘤的作用差异较大，有的有抑制作用，有的甚至作用相反；浓度的高低也会影响肿瘤的发生、发展[14-16]。凤丹籽油对肿瘤细胞，尤其是肝癌细胞是否具有抑制作用的研究鲜见报道。本试验采用GC/MS分析凤丹籽油脂肪酸组成，质谱库检索并结合保留指数验证，旨在更加精准地确定其脂肪酸组分；通过体外细胞试验方法，研究凤丹籽油对人肝癌HepG2细胞增殖抑制作用，为凤丹籽油作为营养及保健食品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

凤丹籽：产自安徽铜陵，采收于2015年，由北京同仁堂安徽中药材公司提供，晾干后经除杂挑选于4 ℃低温贮藏，采用索氏抽提获得凤丹籽油；正己烷(色谱纯)：天津市富宇精细化工有限公司；正构烷烃混标(C7—C40)：Sigma Fluka公司；HepG2细胞株：美国菌种保藏库(ATCC)；胎牛血清：Biological Industries公司；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、双抗(青链霉素混合液)：HyClone公司；CCK-8细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒：上海贝博生物公司；5-氟尿嘧啶(5-FU)：上海瑞永生物科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GC/MS-QP2010型气相色谱/质谱联用仪：日本岛津公司；iMark酶标仪：美国Bio-Rad公司；SC-2556低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；IX51倒置显微镜：日本Olympus公司；3111二氧化碳培养箱：赛默飞世尔科技有限公司；SW-CJ-2D超净工作台：上海鼎科科学仪器有限公司。

1.3 GC/MS分析

1.3.1 甲酯化处理

取凤丹籽油0.2 g于10 mL刻度试管中，加乙醚/石油醚混合溶剂(体积比为1∶1)2 mL使其溶解，再加入浓度为0.4 mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液1 mL，振摇1 min后静置15 min，加蒸馏水至刻度，静置使其分层，移出上层液体并加入无水硫酸钠静置后稀释50倍，用0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。

1.3.2 GC/MS分析条件

色谱条件：色谱柱：HP-5(30 m×0.25 mm×0.25 um)弹性石英毛细管色谱柱；载气：纯度为99.999%的高纯氦气；柱流量：1 mL/min；柱温程序：初始温度100 ℃，保持3 min，以7 ℃/min的速度升至190 ℃，保持15 min；再以10 ℃/min的速度升至260 ℃，保持8 min；分流比20∶1；进样口温度260 ℃，接口温度260 ℃；进样量1.0 μL。

质谱条件：电子源(EI)电离能源：70 eV；EM电压：1 788 V；离子源温度：230 ℃；四级杆温度：150 ℃；质量扫描范围：27～600 amu。

1.3.3 KI值测定[17]

取正构烷烃混标标准品按照试验条件分析，记录每个正构烷烃标准品出峰的保留时间，采用保留指数的线性升温公式：KI=100n+100[(tx-tn)/(tn+1-tn)]，计算各挥发性组分的KI值，式中tx、tn和tn+1(tn

1.4 体外抑制HepG2活性

1.4.1 供试样品的制备

完全培养基：基础培养基+10%胎牛血清+1%双抗(100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)。

试验用凤丹籽油：分别取适量凤丹籽油，加入等量的DMSO溶解，用完全培养基稀释成对应浓度，并使DMSO终浓度均为1%。5-FU：精确称取适量的5-FU粉末，用完全培养基溶解，得到50μg/mL溶液。均采用0.22μm细胞专用微孔滤膜过滤除菌。

1.4.2 细胞培养

HepG2细胞培养于完全培养基内，37 ℃和5%CO2饱和湿度培养箱中培养。HepG2细胞在培养瓶中呈单层贴壁生长，1～2d传代1次，取对数生长期的细胞进行试验。

1.4.3CCK-8法测定凤丹籽油抑制HepG2细胞增殖活性

本试验采用CCK-8法是一种新的检测细胞代谢活性方法，比常用的MTT法灵敏度高，且试剂本身稳定性高，试验结果更稳定可靠[18]。

收集对数生长期细胞，制备成单细胞悬液进行计数，调整细胞浓度为5×104个/mL接种至96孔板，每孔100μL，待细胞完全贴壁后，小心吸出培养液，分别加入浓度为10、5、1、0.5、0.1μL/mL的试验用凤丹籽油，并设有5-FU阳性对照组、正常细胞对照组、溶剂对照组(1%DMSO)、空白组(无细胞，只加培养液)、调零组(加不同浓度含药培养液)，每组各浓度均设6个复孔。加药后置于CO2培养箱中分别培养24、48、72h后，加入10μLCCK-8，继续培养1.5h，在酶标仪上检测吸光度(OD值)，采用双波长测定，检测波长450nm，参比波长655nm。根据公式计算细胞的生长抑制率(IR)。

IR=[1-(给药组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-凋零组OD值)]×100%

1.4.4 凤丹籽油对细胞生长曲线的影响

用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后稀释成6×105、3×105、1.5×105、7.5×104、3.75×104个/mL接种细胞，每个浓度设6个复孔。接种后培养4h使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养1.5h后测定OD值，制作出以细胞数量为横坐标(x轴)，OD值为纵坐标(y轴)的标准曲线。参照方法1.4.3，将得到的吸光度值在标准曲线上计算出相应的细胞数，即可绘出细胞的生长曲线。

1.4.5 数据统计学处理

2 结果与讨论

2.1 凤丹籽油脂肪酸组成及含量分析

对图1中的各峰的质谱图进行NIST2011质谱库检索，选取相似度高的前10个可能物质，分别通过http://webbook.nist.gov/chemistry/搜索文献(HP-5柱)得到其保留指数KI值的文献值，初步确定化学成分。保留指数KI文献结果与保留指数KI计算结果相比较，以质谱匹配度和保留指数KI值接近度最高的化学结构为最佳鉴定结果，同时运用峰面积归一化法得各挥发性组分的相对百分含量，结果见表1。

图1 凤丹籽油脂肪酸甲酯的总离子流色谱图

从表1可以看出，凤丹籽油经GC/MS分析后共鉴定出10种化合物。饱和脂肪酸有5种，占8.416%，以棕榈酸(6.137%)、硬脂酸(2.023%)为主；不饱和脂肪酸有4种，占91.494%，其中单不饱和脂肪酸相对质量分数较低，占0.376%，多不饱和脂肪酸相对质量分数高达91.118%(亚油酸30.424%、α-亚麻酸60.694%)；除主要脂肪酸外，还分析出了少量的奇数碳的脂肪酸(十七酸)和酚类。不饱和脂肪酸及亚油酸含量与钱明月等(89%、33.34%)、毛程鑫等(92%、27.58%)和李喜悦

等(>90%、28.0%)的报道接近，而亚麻酸含量远远高于毛程鑫等(40.50%)、李喜悦等(44.7%)、王芸等(37.84%)所报道的，与钱明月等(54.81%)接近。由此可看出，除了品种、气候条件和生长地域的不同对牡丹籽油脂肪酸组分存在着一定的影响，样品前处理方式和测定方法等因素也是影响鉴定结果差异的主要原因。

常见食用植物油中不饱和脂肪酸质量分数：橄榄油90.10%、茶油90.10%、葵花籽油86.10%、花生油77.30%、大豆油82.00%、菜籽油80.90%[19]。由此可见，凤丹籽油的不饱和脂肪酸含量与橄榄油、茶油相当甚至超过，远高于其他植物油含量。

表2显示了凤丹籽油分别作用24、48、72h对HepG2细胞生长的影响。由表2可知，模型组与正常细胞对照组OD值差异不显著(P>0.05)，说明1%DMSO对HepG2细胞无抑制作用，因此可排除DMSO作为溶剂对考察细胞增殖效果的影响。除低剂量0.1μL/mL外，其他凤丹籽油剂量组与溶剂对照组OD值均有显著差异，表明不同剂量凤丹籽油对HepG2细胞均有抑制作用，但与作为抗癌药物的5-FU相比，其抑制作用均弱于5-FU。

表1 凤丹籽油脂肪酸组分及相对含量

表2 凤丹籽油对HepG2细胞OD值的影响

注：*.与模型组相比，有显著性差异(P<0.05)；**.与模型组比较，有极显著性差异(P<0.01)。#.与阳性对照组比较，有显著性差异(P<0.05)；##.与阳性对照组比较，有极显著性差异(P<0.01)。

2.2 凤丹籽油体外抑制肿瘤细胞活性

从图2可以看出，随着加入凤丹籽油剂量的增加，对HepG2细胞的抑制作用也增加，尤其是10μL/mL剂量组的抑制率急剧上升，以作用72h为例，10μL/mL剂量组的抑制率是0.1μL/mL剂量组的13.66倍，呈现明显的剂量效应。且随着凤丹籽油对HepG2细胞作用时间的延长，其抑制率均有上升，以10μL/mL剂量组为例，作用72h的抑制率是24h抑制率的3.71倍，也表现出一定的时间效应。运用改良寇式法[20]计算凤丹籽油作用72h的IC50为6.05μL/mL。

图2 凤丹籽油对HepG2细胞抑制率的影响

2.3 凤丹籽油对细胞生长曲线的影响

生长曲线体现了细胞在体外培养过程中的增殖动态变化。从图3可以清晰地看出，凤丹籽油对HepG2细胞生长曲线的影响。正常细胞对照组的细胞贴壁后生长迅速，细胞数量随着时间的延长显著上升，而凤丹籽油作用后的细胞增殖速度均低于正常细胞。随着凤丹籽油剂量的增加，HepG2细胞增长越缓慢，在72h，10、5μL/mL的凤丹籽油作用HepG2细胞出现负增殖，表现出一定的剂量效应。随着作用时间的延长，HepG2细胞增殖降低，以10μL/mL剂量组为例，作用72h的细胞数量是48h的0.45倍，出现负增殖，呈现了一定的时间效应。

图3 凤丹籽油对HepG2细胞生长曲线的影响

前期资料表明，n3和n6多不饱和脂肪酸的不同配比对肿瘤抑制效果不同[21]，所以调节凤丹籽油的n3/n6比提高其肿瘤抑制效果，值得进一步关注。本试验结论仅限于体外细胞试验，其生物学效应尚需开展动物体内试验进行考证。

3 结论

利用GC/MS分离检测，采用峰面积归一化法估算各组分相对含量，并采用MS谱库检索结合保留指数对凤丹籽油组分进行结构鉴定可知，凤丹籽油不饱和脂肪酸占91.494%，含量最为丰富的物质为α-亚麻酸(60.694%)，其次为亚油酸(30.424%)。从抑制率、生长曲线可知，凤丹籽油对HepG2细胞生长增殖有效地抑制，且抑制效果呈现一定的时间、剂量效应。

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