酶法提取小球藻藻渣多糖研究

刘启顺，陈 玮，左 杨, ，吴树丽, ，谭海东，曹旭鹏，张付云，尹 恒

( 1. 中国科学院 大连化学物理研究所，生物技术部，辽宁 大连 116023；2. 大连海洋大学 食品科学与工程学院，辽宁 大连 116023 )

小球藻(Chorella)是一种球形或者椭球形普生性单细胞绿藻，细胞直径2～12 μm，主要生长在土壤、潮湿的岩石表面及淡水中[1]。小球藻生态分布广，生长速度快，易于培养，应用价值高，小球藻对盐度、温度等变化适应能力强，培养简便，繁殖快，适合大规模养殖[2]。

小球藻含有丰富的蛋白质、脂质、多糖、核酸、膳食纤维及叶绿素等，这些营养素是维持和促进人体健康所不可缺少的[3]。小球藻在正常生长条件下，其细胞中蛋白质含量不低于50%，脂类的含量约为25%。在氮饥饿条件下，蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)生长时脂类含量最高可达86%，碳水化合物含量也近20%，叶绿素含量为4%～6%[4-5]。

目前，国内外关于小球藻中多糖的报道主要集中在对小球藻水溶性多糖的分离纯化、糖链结构分析以及生物活性等方面的研究[6-11]。邓永智等[7]对小球藻多糖的提取工艺进行了优化，发现用超声波辅助乙酸溶液提取法提取效果最好，而且用pH由低到高的水溶液提取得到的多糖其单糖组成和单糖比例不尽相同，为小球藻多糖的提取和多糖结构的分析提供了一定的参考方法。施英等[12]研究了蛋白核小球藻粗多糖的细胞免疫和巨噬细胞吞噬作用及其体液免疫的功能，发现蛋白核小球藻粗多糖对小鼠的免疫功能有显著的调节作用，其活性与蛋白核小球藻多糖的剂量相关。

近年来，全球面临能源短缺、资源缺乏和环境保护压力，生物资源的利用和生物能源的开发引起了广泛的关注。小球藻光合效率高、生长速度快、油脂含量高，使其成为开发生物柴油的重要原料[13]。在小球藻提取油脂之后，剩下的富含多糖的藻渣作为废弃物，目前没有有效利用的技术。

以小球藻藻渣高值化利用为出发点，开发小球藻藻渣多糖绿色提取工艺。通过系列糖苷酶和蛋白酶的筛选，发现一种高效酶法提取藻渣多糖方法，利用正交试验优化藻渣酶法提取多糖的工艺，并构建了糖苷酶和蛋白酶串联提取小球藻藻渣多糖的新工艺，实现小球藻藻渣多糖的高效绿色提取，以期为小球藻藻渣高值化开发提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小球藻藻粉购于山东滨州天健生物科技有限公司；小球藻藻渣(自制)；纤维素酶(2×106U)、果胶酶(2×106U)、半纤维素酶(1×106U)、酒精酶(2×106U)、中性蛋白酶(2×106U)、木瓜蛋白酶(2×106U)、酸性蛋白酶(2×106U)均购于上海和氏璧化工有限公司。BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术研究所)；浓硫酸、蒽酮、浓盐酸、氨水、乙酸和乙醇(95%)(国产分析纯)。高速冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；KS-250超声波细胞粉碎机(宁波科生仪器厂)；752型紫外光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；LIBROR AEG-120电子天平(日本Shimadzu公司)；超级恒温器(VJ501)(上海跃进医疗器械厂)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)；pH计(Mettler Toledo)；JB-2型恒温磁力搅拌器(上海雷磁新泾仪器有限公司)；全自动多功能酶标仪(Labsystems multiskan Ascent，美国Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 小球藻藻渣的制备

精确称取小球藻干粉30 g，加入去离子水1000 mL混匀。混合液超声(50 W, 10 min, 2次)破碎。混合液破碎后80 ℃水浴2 h，4500 r/min离心20 min取沉淀，去离子水复溶重复以上操作。沉淀用1000 mL去离子水洗3次，4500 r/min离心20 min取沉淀于烘箱中80 ℃干燥24 h，研磨过90目筛即得小球藻藻渣。

1.2.2 提取小球藻藻渣多糖工具酶的筛选

采用糖苷酶(酒精酶、纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶)以及蛋白酶(中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶)对小球藻藻渣多糖进行提取。具体试验步骤为：取1 g小球藻藻渣干粉，加入50 mL去离子水混匀，平行3组。混合液用乙酸或氨水调节每种酶的最适pH，然后加入0.02 g酶，在各个酶的最适温度恒温搅拌，同时做空白对照。反应2、4、6、8、12、24 h时取样0.5 mL于沸水浴灭酶活，4000 r/min离心10 min，取上清液，测定总糖及蛋白含量，作提取液中总糖及蛋白含量随反应时间变化曲线。

1.2.3 3种酶提取藻渣多糖正交试验

考虑影响酶法提取多糖反应的因素，设计一个五因素四水平的正交试验。正交试验5个因素4个水平，其中A为反应液的pH值，B为加酶量(mg)，C为底物含量(%)，D为反应温度(℃)，E为提取时间(h)。

纤维素酶提取藻渣多糖的正交试验的条件为：pH分别为4.0、4.5、4.8、5.5；加酶量分别为5、10、20、40 mg；底物含量分别为1%、2%、5%、10%；提取温度分别为40、45、50、55 ℃；提取时间分别为6、12、20、28 h。

果胶酶提取藻渣多糖正交试验的条件为：pH分别为3.5、4.0、4.5、5.0；加酶量分别为5、10、20、40 mg；底物含量分别为1%、2%、5%、10%；提取温度分别为35、40、45、50 ℃；提取时间分别为6、12、20、28 h。

中性蛋白酶提取藻渣多糖正交试验的条件为：pH分别为6.5、7.0、7.5、8.0；加酶量分别为5、10、20、40 mg；底物含量分别为1%、2%、5%、10%；提取温度分别为35、40、45、50 ℃；提取时间分别为6、12、20、28 h。

1.2.4 复合酶串联提取藻渣多糖

根据正交试验得出的3种酶的最佳反应条件，采用纤维素酶、果胶酶分别与中性蛋白酶复合串联提取小球藻藻渣多糖，分别在1、2、4、8、12、20、21、22、24、28、32、40 h取样，0.5 mL于沸水浴灭酶活，4000 r/min离心10 min，取上清液，测定总糖及蛋白含量，作提取液中总糖及蛋白含量随反应时间变化曲线。

1.2.5 总糖含量测定和计算

采用硫酸—蒽酮方法测定多糖提取液的总糖，具体方法参考文献[14]。计算公式如下：

式中，M为样品中总糖的质量分数(%)，C为从标准曲线中查出的糖质量浓度(μg/mL)，V为样品稀释后的总体积(mL)，m为样品的质量(g)。

1.2.6 小球藻多糖蛋白含量的测定

采用BCA法测定多糖提取液中的蛋白含量，具体方法参考文献[15]。计算公式如下：

式中，M为样品中蛋白的质量分数(%)，C为从标准曲线中查出的蛋白质量浓度(μg/mL)，V为样品稀释后的总体积(mL)，m为样品的质量(g)。

1.2.7 多糖和蛋白提取率计算方法

计算公式如下：

式中，m1为计算出来的多糖或蛋白的质量(g)，m2为反应时投入的小球藻藻渣样品质量(g)。

2 结果与分析

2.1 单一酶提取藻渣多糖试验

2.1.1 糖苷酶提取藻渣多糖试验

用纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶和酒精酶等4种糖苷酶对小球藻藻渣的多糖进行提取，反应时间曲线见图1。4种糖苷酶对多糖的提取率分别为6.04%、5.89%、4.89%和3.58%。纤维素酶和果胶酶的效果比较好，这与小球藻的细胞壁的结构组成[10]吻合。后续采用纤维素酶和果胶酶进行进一步试验。另外4个糖苷酶在提取多糖时，蛋白含量也随时间延长而增加，其含量分别为2.11%、2.01%、2.61%和2.30%(图1)。对多糖提取液进行多种蛋白去除处理，发现均未能有效去除，说明小球藻藻渣的多糖可能含有蛋白聚糖。为此，进一步尝试采用蛋白酶提取其多糖。

图1 单一糖苷酶提取小球藻藻渣多糖时间曲线a:纤维素酶；b：果胶酶；c：半纤维素酶；d：酒精酶.

2.1.2 单一蛋白酶提取藻渣多糖试验

用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶对小球藻藻渣多糖提取反应的时间曲线见图2，多糖提取率分别为12.24%、6.64%和7.02%，同时蛋白的提取率为8.14%、4.19%和3.60%，说明小球藻藻渣中多糖确实含有蛋白聚糖。3种蛋白酶中，中性蛋白酶的活性远高于其他两种蛋白酶，后续的试验中采用中性蛋白酶进行试验。

图2 单一蛋白酶提取小球藻藻渣多糖时间曲线a：中性蛋白酶；b：木瓜蛋白酶；c：酸性蛋白酶.

2.2 3种酶提取藻渣多糖的正交试验

单一酶提取小球藻藻渣多糖的试验表明，糖苷酶中纤维素酶和果胶酶以及中性蛋白酶的提取效率较好。为进一步提高3种酶对小球藻藻渣多糖的提取效率，笔者对3种酶提取多糖进行正交试验优化。

2.2.1 纤维素酶正交试验

纤维素酶提取小球藻藻渣多糖正交试验的条件见表1，正交试验结果见表2。

表1 纤维素酶提取小球藻藻渣多糖反应的正交试验条件

表2 纤维素酶正交试验的结果

正交试验中极差表示指定因素1～4组平均值的最大值与最小值的的差，极差值的大小体现此因素对提取过程的影响程度(表2)。加酶量的极差最大，其值为4.58(9.03～4.45)，表明提取过程的加酶量对小球藻藻渣多糖的提取影响最大。在加酶量因素的4个水平的平均值中，水平4的平均值最大，因此确定此提取过程的最适加酶量为40 mg。试验16的多糖提取率最大，为10.78%。因此初步确定的最佳提取条件为：反应液pH 5.5；加酶量40 mg；底物含量1%；提取液温度50 ℃；提取时间20 h。

根据正交试验结果的方差分析表分析得出，pH值、加酶量、底物含量、温度、时间对反应的影响均不显著(表3)。

表3 纤维素酶正交试验方差分析

2.2.2 果胶酶正交试验

果胶酶提取小球藻藻渣多糖正交试验的条件见表4，正交试验结果见表5。

表4 果胶酶提取小球藻藻渣多糖反应的正交试验条件

表5 果胶酶正交试验的结果

反应温度的极差最大，其值为2.03(8.96～6.93)，表示提取过程的温度对小球藻藻渣多糖的提取影响最大(表5)。在反应温度因素的4个水平的平均值中，水平1的平均值最大，因此确定此提取过程的最适温度为35 ℃。试验12组的多糖提取率最大，为11.53%。因此初步确定的最佳提取条件为：反应液pH 4.5；加酶量40 mg；底物含量2%；提取温度35 ℃；提取时间20 h。

根据正交试验结果的方差分析表分析得出，pH、加酶量、底物含量、温度、时间对反应的影响都均不显著(表6)。

表6 果胶酶正交试验方差分析

2.2.3 中性蛋白酶正交试验

中性蛋白酶提取小球藻藻渣多糖正交试验的条件见表7，正交试验结果见表8。

加酶量的极差最大，其值为4.63(10.25～5.62)，表示提取过程的加酶量对小球藻藻渣多糖的提取影响最大(表8)。在加酶量因素的4个水平的平均值中，水平4的平均值最大，因此确定此提取过程的加酶量为40 mg。试验12组的多糖提取率最大，为17.71%。因此初步确定的最佳提取条件为：提取液pH 7.5；加酶量40 mg；底物含量2%；提取温度35 ℃；提取时间20 h。

根据正交试验结果的方差分析表分析得出，pH值、加酶量、底物含量、温度、时间对反应的影响都不显著(表9)。

2.3 双酶串联提取小球藻藻渣多糖

由于小球藻藻渣中多糖含有蛋白聚糖，糖苷酶和蛋白酶组成的复合酶能提高多糖的提取率。根据正交试验优化后的试验条件，采用纤维素酶和中性蛋白酶串联以及果胶酶和中性蛋白酶串联的方法。两种双酶串联法提取小球藻藻渣多糖的反应时间曲线(图3、图4)。

由图3和图4可见，采用纤维素酶和中性蛋白酶串联提取小球藻藻渣多糖提取率为20.80%，果胶酶和中性蛋白酶串联提取小球藻藻渣多糖的提取率为20.19%，远高于单个酶的提取效率，也明显高于两个酶单独提取率的加和，提取率提高近一倍。

表7 纤维素酶提取小球藻藻渣多糖反应的正交试验条件

表8 果胶酶正交试验的结果

表9 中性蛋白酶正交试验方差分析

图3 纤维素酶和中性蛋白酶串联提取小球藻藻渣多糖

图4 果胶酶和中性蛋白酶串联提取小球藻藻渣多糖

3 讨 论

3.1 单一酶提取藻渣多糖试验

提取藻渣多糖通常采用碱提[16]和超声辅助提取[17-18]的方法，但是这些方法存在条件苛刻、设备腐蚀和产物后处理繁琐的问题。生物酶法提取多糖具有条件温和、效率高和过程绿色的优势，近年来广受关注。本试验针对小球藻藻渣多糖结构的特点[19],首先筛选了4种糖苷酶，包括纤维素酶、果胶酶、酒精酶、半纤维素酶，研究其对小球藻藻渣多糖的提取效果，发现纤维素酶和果胶酶的效果较好。这与小球藻藻渣主要含有葡萄糖、甘露糖和半乳糖等中性糖和果胶、半纤维素较少的特点吻合[20]。在糖苷酶提取多糖的过程中，随着提取液中多糖含量的增加，蛋白含量也随之增加，对多糖提取液进行多种方法除蛋白处理，发现均未能有效去除，说明小球藻藻渣的多糖可能含有蛋白聚糖。采用3种蛋白酶包括中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶提取小球藻藻渣多糖，3种蛋白酶均具有活性，其中中性蛋白酶的活性最高。与糖苷酶提取多糖过程类似，随着提取液中蛋白含量的升高，多糖的含量也随着升高。基于此结果，采用糖苷酶和蛋白酶组成的复合酶提取可能会大大提高多糖的提取率。

3.2 3种酶提取藻渣多糖的正交试验

酶法提取多糖过程涉及多个因素，包括反应液pH值、加酶量、底物含量、提取液温度和提取时间。正交试验是多因素试验的有效优化工具[21]，笔者对筛选出的3种酶，包括纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶对小球藻藻渣多糖的提取过程进行了正交试验优化。试验结果发现，虽然经方差分析，pH值、加酶量、底物含量、温度和时间对提取过程的影响均不显著，但是优化后3种酶的提取效率均得到明显提高，中性蛋白酶的提取率提高近40%，而两个糖苷酶的提取率更是由约6%提至约11%，果胶酶的提取率更是提高超过一倍。正交试验的结果为糖苷酶—蛋白酶复合串联提取小球藻藻渣多糖奠定了基础。

3.3 双酶串联提取小球藻藻渣多糖

小球藻藻渣中的多糖含有蛋白聚糖，采用糖苷酶和蛋白酶复合提取效率会高于单一酶的提取效率。如果蛋白酶与糖苷酶同时加入，蛋白酶会将糖苷酶降解。因此，本试验采取先用糖苷酶、后用蛋白酶的双酶串联法提取小球藻藻渣多糖。采用正交试验优化后的提取工艺条件，纤维素酶和中性蛋白酶串联以及果胶酶和中性蛋白酶串联提取小球藻藻渣多糖的工艺，多糖提取率分别达到20.80%及20.19%，远高于单一酶的提取效率，也明显高于两个酶单独试验时提取率的加和，提取率提高近一倍；在提取时间上，复合酶串联提取工艺也短于两个单一酶提取时间之和。

由试验结果可以看出，本研究开发的糖苷酶—蛋白酶双酶串联提取工艺可在温和条件下，高效绿色提取小球藻藻渣中的多糖，为后续小球藻藻渣多糖的生物活性研究及进一步高值化利用开发提供了技术基础，进而促进小球藻产业的发展。同时，双酶串联提取多糖工艺对其他资源多糖的提取利用过程具有借鉴意义。

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