半滑舌鳎源蜡样芽孢杆菌毒性检测及药敏试验

王 琰，高四合，单建杰，罗 璋，刘金兰

( 1.天津农学院 水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384；2. 天津市水产研究所，天津 300221 )

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用菌株L1分离自有典型临床出血症状的半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)，由天津农学院水产动物病害实验室保种。斑马鱼购自天津市中环花鸟鱼虫市场，全长为3.0～3.5 cm，均健康无病，经过1周暂养，待试验鱼稳定后，用于试验。

1.2 16S rDNA鉴定

1.2.1 制备模板

将菌株L1用2216E液体培养基培养至对数生长期(12 h)，按照天根生化科技(北京)有限公司的细菌总DNA提取试剂盒(DP302-02)说明书步骤操作，提取细菌总DNA，即为模板DNA。

1.2.2 16S rDNA基因序列的扩增

扩增16S rDNA基因所用引物为细菌16S rDNA通用引物27 F和1492 R。PCR反应体系(50 μL)包括：2×Taq PCR Mix(天根)25 μL，25 μmol/L的引物各1 μL，模板DNA 1 μL，用灭菌超纯水调整终体积至50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35个循环。通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并送交上海生工生物技术工程有限公司进行基因测序。

1.2.3 系统发育树的构建

将菌株L1的16S rDNA基因序列与GenBank中已报道的核酸序列进行在线Blast分析，调出与该序列同源性较高的核酸序列，并与通过LPSN下载的相关菌株16S rDNA基因序列及同种不同株系的16S rDNA基因序列进行比较。将上述序列使用Mega 5.2完成序列比对后，采用邻接法构建系统发育树。

1.3 蜡样芽孢杆菌6种主要毒力基因PCR检测

蜡样芽孢杆菌的6种主要毒力基因为：与腹泻毒素相关的溶血素BL基因(hblC)、肠毒素T基因(bceT)、细胞毒素K基因(CytK)、呕吐基因(ces)、多效调控因子(plcR)、非溶血性肠毒素(nheA)。引物序列、退火温度及扩增片段大小见表1，引物由上海生工生物技术工程有限公司合成，PCR反应体系和产物电泳检测和测序与1.2.2相同。

表1 引物序列及扩增产物长度

1.4 胞外酶及溶血素定性分析

参照文献[12]胞外酶及溶血素定性分析中的方法，将菌株L1接种到2216E培养基上，经30 ℃恒温培养(24 h)后观察结果。溶血素培养基(含质量分数7%家兔脱纤维血)，若菌落周围出现透明的血圈为阳性，反之为阴性。蛋白酶培养基(含质量分数10%脱脂牛奶)，若菌落周围出现透明区环，可在其表面滴加1%氯化汞溶液，如仍保持不变为阳性。脂肪酶培养基(含质量分数1%吐温80)，菌落周围有白色沉淀带，则含脂肪酶。淀粉酶培养基(含质量分数1%淀粉)，于菌落上滴加I2-KI观察结果。若有淀粉酶，菌落周围培养基变透明。若无淀粉酶，则培养基与碘反应出现紫色。尿素酶培养基(含质量分数2%尿素和1%酚红)，若菌落含尿素酶，尿素酶水解尿素使培养基成碱性，酚红显色成粉红色。

1.5 半数致死密度测定

试验分6组，每组2个平行，每个平行15尾斑马鱼。取菌株L1经普通琼脂培养基培养24 h，用无菌生理盐水稀释成密度为1.00×109、1.00×108、1.00×107、1.00×106、1.00×105cfu/mL菌液。分别腹腔注射每组鱼体，每尾10 μL。对照组注射等量的生理盐水。注射后，每日观察死亡情况。采用概率单位法计算半数致死密度。

1.6 药敏试验

参照《药品微生物学检验手册》采用纸片法进行药敏试验，药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司，并根据说明书对敏感度进行判定。

2 结果与分析

2.1 DNA与16S rDNA扩增结果

自菌株L1提取的DNA条带单一完整、明亮(图1a)。经通用引物扩增后的16S rDNA片段大小为1375 bp(图1b)。

2.2 系统发育树的构建

采用邻接法基于菌株L1的16S rDNA基因序列构建的系统发育树见图2。由图2可见，菌株L1与蜡样芽孢杆菌X2、EB-31为同一支，亲缘关系较近，相似性为99%。

2.3 毒力基因的检测及序列分析

经PCR检测，发现L1的DNA中除ces外，存在CytK、bceT、hblC、plcR、nheA 5种毒力基因。并测得5种毒力基因片段大小分别为537、400、669、581、477 bp(图3)。

图1 凝胶电泳图谱a. L1基因组DNA的凝胶电泳图谱；b. L1 16SrDNA基因扩增电泳图谱注：M：MakerⅢ；A中1,2：L1基因组DNA；B中1～4：16SrDNA PCR产物.

图2 菌株L1的系统发育树

图3 菌株L1毒力基因扩增电泳图谱M，MakerⅢ；1，CytK；2，bceT；3，hblC；4，ces；5，PlcR；6，nheA.

2.4 胞外酶及溶血素活性

溶血素培养基中菌落周围可以明显看到透明的溶血圈(图4a)，因此表明菌株L1中含溶血素；培养48 h后蛋白酶培养基中菌落周围出现透明区环，在其表面滴加1%氯化汞溶液，透明区环保持透明不变，则菌株L1中含蛋白酶(图4b)；在淀粉酶培养基中菌落上滴加I2-KI，菌落周围培养基变透明(图4c)，表明菌株L1中含淀粉酶；脂肪酶培养基中菌落周围出现白色沉淀带(图4d)，表明菌株L1中含脂肪酶；尿素酶培养基上，划线部分变粉红，试管下部未接种细菌部分不变粉红，表明菌株L1含尿素酶(图4e)。综上所述，经检测菌株L1胞外酶含溶血素、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、尿素酶。

2.5 半数致死密度的测定

以不同细菌密度人工注射斑马鱼，养殖24 h后，高于1.00×105cfu/mL密度组开始出现死亡，而1.00×105cfu/mL密度组和对照组死亡率为0。试验结果见表2，经计算96 h半数致死密度为3.26×108cfu/mL。

死亡斑马鱼腹部红肿，皮肤充血、出血、溃烂，与患细菌性疾病的半滑舌鳎的症状相吻合。在死亡斑马鱼病灶处分离出优势菌，经鉴定为蜡样芽孢杆菌。

2.6 药敏试验

蜡样芽孢杆菌L1对30种常见抗生素的药物敏感性结果见表3，结果显示，蜡样芽孢杆菌L1对头孢他啶、氨曲南、阿莫西林等10种药物耐药，对红霉素、环丙沙星、多粘菌素B等5种药物中度敏感，对庆大霉素、克林霉素、阿米卡星等15种药物敏感。

表2 半数致死密度测定试验结果

图4 溶血素和胞外酶的活性检测试验结果a溶血素，b蛋白酶，c淀粉酶，d脂肪酶，e尿素酶.

抗生素抑菌圈直径/mm敏感性抗生素抑菌圈直径/mm敏感性头孢他啶11．5±0．4R庆大霉素23．2±0．6S头孢噻肟6．0±0．5R克林霉素24．3±0．2S头孢唑啉9．0±0．4R阿米卡星26．2±0．4S头孢曲松0．0±0．0R新霉素20．1±0．3S头孢呋辛0．0±0．0R链霉素22．5±0．7S氨曲南0．0±0．0R麦迪霉素27．3±0．3S阿莫西林0．0±0．0R妥布霉素17．4±0．7S氨苄西林0．0±0．0R卡那霉素20．4±0．3S复方新诺明0．0±0．0R哌拉西林21．3±0．5S青霉素G0．0±0．0R左氟沙星22．1±0．2S红霉素20．8±0．7I头孢哌酮24．9±0．4S环丙沙星20．3±0．2I万古霉素17．5±0．01S米诺环素18．7±0．2I大观霉素21．4±0．3S多粘菌素B10．0±0．3I氧氟沙星23．3±0．2S头孢西丁15．3±0．1I阿奇霉素18．0±0．2S

注：R，耐药；I，中度敏感；S，敏感.

3 讨 论

3.1 蜡样芽孢杆菌16S rDNA鉴定

3.2 蜡样芽孢杆菌的毒力基因

蜡样芽胞杆菌毒力基因和潜在的致病性研究，国内外已有不少报道，多数集中于陆上动物及食品检测中[3,4,13,18]。已有研究表明，分离到的蜡样芽孢杆菌主要含与腹泻毒素相关的溶血素BL基因、肠毒素T基因、细胞毒素K基因、多效调控因子、非溶血性肠毒素和与呕吐相关的呕吐基因[6,18]，其中溶血素BL基因具有溶血性、细胞毒性，可引起皮肤溃烂、溃疡和充血、淤血等症状[5,19]；肠毒素T基因控制肠毒素蛋白的合成[5,20]；细胞毒素K基因对人类肠道上皮细胞具有毒性作用[5,21]；多效调控因子可以激活多种编码毒力基因的表达，例如可以编码磷脂酶C、蛋白酶和溶血素等基因的表达[6]；非溶血性肠毒素可以控制一种金属蛋白，该蛋白具有分解明胶和胶原的活力[5,22]；呕吐基因可以产生呕吐毒素，该毒素能保持完整并且转化为活性毒素吸附在内脏[5,18]。本试验自蜡样芽孢杆菌L1基因组中检测到溶血素BL基因、肠毒素T基因、细胞毒素K基因、多效调控因子和非溶血性肠毒素5种与腹泻相关的毒力基因，未检测到与呕吐相关的呕吐基因。因多效调控因子和细胞毒素K基因可引起皮肤的溃烂、充血和淤血等症状，与功毒后死亡斑马鱼的症状相吻合；而细胞毒素K基因又能激活溶血素BL基因的表达，从而加速溶血素的产生，危害鱼类健康。综上所述，蜡样芽孢杆菌所含的5种毒力因子共同作用其毒素的产生。

3.3 蜡样芽孢杆菌的胞外产物

本试验自蜡样芽孢杆菌L1的胞外产物中检测到了分泌到机体组织而引起组织细胞的坏死，继而使动物发病甚至死亡的胞外酶如溶血素、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和尿素酶。且被攻毒的斑马鱼出现水肿、充血乃至死亡，这与胞外蛋白酶分解宿主组织蛋白质，溶血素可导致机体出血，形成全身性毒血症、败血症等[23]，脂肪酶能分解脂质[24]和尿素酶能分解尿素产生NH3，在菌体周围形成碱性环境[25]等病理机制相一致。这些结果表明该菌株对水产动物具有很强的致病性。

3.4 蜡样芽孢杆菌的攻毒试验

斑马鱼(Daniorerio)是一种理想的脊椎动物模式生物，被认为是一种监测水体污染物的动物模型, 用于检测致畸性和有毒物质[26]。本试验经测定96 h半数致死密度为3.26×108cfu/mL，可见其毒力相对较弱。死亡斑马鱼的现象与患病半滑舌鳎相吻合，分离出的细菌经证实为蜡样芽孢杆菌，说明该菌不仅有使半滑舌鳎患病的能力，还能引起水中其他生物的疾病。国标急性毒性试验测出的试验结果客观、准确，但是时间久、可重复性差[27]，因此可以与分子生物学方面毒力基因的检测结合，更快速、准确的检测细菌毒力。

3.5 蜡样芽孢杆菌的药敏试验

本试验中的药敏试验结果显示蜡样芽孢杆菌L1对庆大霉素、克林霉素、阿米卡星等15种药物敏感。为临床上可选用药物来预防或治疗蜡样芽孢杆菌引起的疾病提供参考，且应该在国家渔业药用准则允许的条件下，有针对性地选择药物用于疾病防治。

来源于水环境的蜡样芽孢杆菌尽管携带溶血素BL基因、肠毒素T基因、细胞毒素K基因等毒力基因并能分泌溶血素毒素，其能否通过鱼源食材传染恒温的陆上动物并在陆上动物体内增殖继而引起陆上动物中毒即为下一步的研究方向。

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