大豆异黄酮对褐牙鲆免疫细胞功能的体外研究

袁 瑞，杨 宁，姜 秦，王正丽

( 青岛农业大学，海洋科学与工程学院，山东 青岛 266109 )

鱼粉是水产饲料的优质蛋白源，然而，近年来过度捕捞和不良气候使鱼粉产量降低，鱼粉价格逐年增长[1]。寻找优质廉价的替代蛋白源成为水产饲料研究的主要问题之一。大豆蛋白消化吸收率高、价格低、资源丰富，可作为替代蛋白源成为研究热点[2]。

但是，大豆蛋白中所含有的抗营养因子限制了其利用[3]。其中大豆异黄酮属于黄酮类化合物，是大豆中较为常见的抗营养因子，在饲料中超过一定剂量对动物的生长、健康及对饲料中营养物质的利用率均有负面作用[4-6]。研究发现，饲料中豆粕对鱼粉的替代水平超过75%时，影响罗非鱼(Oreochromissp.)的生长、消化酶和转氨酶活性，而这与豆粕中所含的抗营养因子大豆异黄酮的含量相关[4]；在饲料中添加1～3 g/kg大豆异黄酮对褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)生长无显著影响，但添加量达到4 g/kg时，显著抑制褐牙鲆生长[5]。也有研究表明，饲料中适量的大豆异黄酮对动物生长有一定促进作用[6-8]。Zhou等[6]发现，随着饲料中大豆异黄酮含量的增加，卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)的生长性能显著提高，40 mg/kg为最适添加量，添加量达60～80 mg/kg时则表现出抑制作用。而对陆生动物中的研究则表明，除了影响生长，大豆异黄酮无论在体内或体外还具有免疫调节作用[9-10]，能够提高小鼠的杀伤细胞反应[11]、调节人类的细胞免疫[12]等。但目前有关大豆异黄酮对鱼类影响的研究多集中在豆粉替代鱼粉后对鱼类生长产生的影响上，研究结果也存在较大的差异。大豆异黄酮是否具有增强鱼类免疫的作用及其相关机理仍不明确。因此，为进一步研究大豆异黄酮对鱼类的免疫效应，笔者建立了离体细胞模型，研究了离体条件下大豆异黄酮对褐牙鲆相关免疫细胞的免疫效应。

褐牙鲆是我国北方沿海地区广泛养殖的重要海水鱼类之一[13]。头肾巨噬细胞[14]和外周血白细胞[15]是褐牙鲆重要的免疫细胞，在褐牙鲆免疫过程中起重要作用。本试验旨在研究大豆异黄酮对体外培养的褐牙鲆头肾巨噬细胞和外周血白细胞免疫力的影响，明确大豆异黄酮对褐牙鲆的免疫细胞是否具有免疫促进抑或抑制作用，为大豆异黄酮在水产养殖饲料中的添加以及植物蛋白源的合理开发和利用提供试验依据。为寻求新的水产养殖饲料原料替代品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用褐牙鲆购自日照某养殖场，体质量(250±12) g，健康无伤，暂养于海水循环系统中。水温17～19 ℃，盐度32～40，溶氧8.0 mg/L以上，每日投喂商品饲料两次。

1.2 细胞的分离培养

1.2.1 褐牙鲆头肾巨噬细胞的分离培养

在超净台内剖取褐牙鲆头肾，研磨备用。采用Ortuńo的方法分离褐牙鲆头肾巨噬细胞[16]，将头肾研磨液过100目筛绢，加入到34%/51% percoll(Solarbio公司)分离液的液面，4 ℃，2200 r/min离心25 min，吸取中间层巨噬细胞；然后加入3 mL 0.15 mol/L磷酸盐缓冲液，1200 r/min离心5 min后洗涤两次，加入2% FBS-L-15(添加1%双抗、4%抗凝剂、2%胎牛血清)重悬得巨噬细胞。

1.2.2 外周白细胞的分离

在无菌条件下，用含有抗凝剂的注射器尾静脉抽血，分离外周血白细胞[17]。取稀释血液加入到60% Percoll分离液液面上，4 ℃，2200 r/min离心25 min后，从上到下依次为血浆层、白细胞层、粒细胞层、红细胞层，于白细胞层轻轻吸取白细胞；加入3 mL 0.15 mol/L磷酸盐缓冲液，1200 r/min离心5 min后洗涤两次，用2% FBS-L-15重悬得白细胞。

1.2.3 细胞计数及培养

用台盼蓝法检测分离头肾细胞和白细胞活性[16]，用2% FBS-L-15培养基调整这两种细胞的密度为107个/mL，分别接种到96孔板中，每孔100 μL细胞液，放置于19 ℃恒温培养箱培养2 h后，弃上清液以去除未贴壁细胞，然后分别加入100 μL含有0、0.1、0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL大豆异黄酮的细胞培养液(添加不同质量浓度大豆异黄酮的2% FBS-L-15培养基)，放于19 ℃恒温培养箱中继续培养24 h，每个梯度设置4个重复。

1.3 免疫指标测定

1.3.1 氧呼吸爆发活力测定

采用Dolmatova[18]的方法稍作修改。吸弃细胞培养液上清，每孔中加入100 μL氯化硝基四氮唑蓝溶液[质量浓度为1 mg/mL，含有10 μL 1 mg/mL的乙酸肉豆蔻佛波醇]，在19 ℃恒温培养箱避光孵育40 min后吸弃上清液，加入200 μL 100%甲醇固定10 min，用200 μL 70%甲醇洗涤细胞两次后每孔加入120 μL KOH(2 mol/L)和140 μL二甲基亚砜(100%)，用酶标仪在620 nm测定吸光值。

1.3.2 增殖活力测定

采用MTT法[19]稍作修改。不同细胞中加入10 μL噻唑蓝(5 mg/mL MTT)，19 ℃恒温培养箱避光孵育4 h，吸弃上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(100%)，用酶标仪在490 nm测定吸光值。

1.3.3 吞噬活力的测定[19-20]

1.3.3.1 头肾巨噬细胞吞噬活力

在每孔细胞中加入20 μL密度为5×108cfu/mL的自制鳗弧菌悬液，19 ℃恒温培养箱中培养5 h；吸弃上清液后再每孔加100 μL 0.2%的吐温-20，反应10 min后加10 μL噻唑蓝(MTT 5 mg/mL)，19 ℃恒温培养箱中培养4 h；吸弃上清液后，每孔再加150 μL二甲基亚砜(100%)10 min后，用酶标仪在490 nm下测定吸光值。

1.3.3.2 外周血白细胞吞噬活力

将培养后的外周血白细胞96孔板1000 r/min离心，吸弃上清液。每孔加入0.075%的中性红溶液100 μL，19 ℃恒温培养箱中培养1 h；离心弃上清液，用200 μL 0.15 mol/L 磷酸盐缓冲液洗净未被吞噬的中性红；每孔加150 μL细胞裂解液(乙酸∶无水乙醇=1∶1)，19 ℃恒温培养过夜反应后，用酶标仪测定510 nm下的吸光值。

1.4 统计分析

试验数据用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，当P<0.05时认为差异显著，进行Duncan多重比较。

2 结 果

在体外培养条件下，大豆异黄酮对褐牙鲆头肾巨噬细胞和外周血白细胞免疫力有显著影响(P<0.05)，且随着培养液中大豆异黄酮质量浓度的增加，细胞免疫力呈先增加后降低的趋势。

2.1 不同质量浓度大豆异黄酮在体外对褐牙鲆头肾巨噬细胞免疫力的影响

2.1.1 对褐牙鲆头肾巨噬细胞氧呼吸爆发活力的影响

体外培养条件下，细胞培养中不同质量浓度大豆异黄酮显著影响褐牙鲆头肾巨噬细胞的氧呼吸爆发活力(P<0.05)(图1)。当大豆异黄酮质量浓度为0.5 mg/mL时，褐牙鲆巨噬细胞氧呼吸爆发活力显著高于对照组和其他处理组(P<0.05)，而最高质量浓度组(2 mg/mL)的氧呼吸爆发活力显著低于最低质量浓度组(0.1 mg/mL)(P<0.05)，其他处理组之间差异不显著(P>0.05)。

图1 不同质量浓度大豆异黄酮在体外对褐牙鲆头肾巨噬细胞氧呼吸爆发活力的影响

2.1.2 对褐牙鲆头肾巨噬细胞增殖活力的影响

细胞培养液中大豆异黄酮质量浓度为0.1、0.5、1.0 mg/mL时，褐牙鲆头肾巨噬细胞增殖活力显著增加(P<0.05)，在质量浓度为0.5 mg/mL时活力最高；随着大豆异黄酮质量浓度的增加，褐牙鲆头肾巨噬细胞增殖活力显著降低，当大豆异黄酮质量浓度为2 mg/mL时，头肾巨噬细胞增殖活力最低，显著低于对照组和其他处理组(P<0.05)(图2)。

图2 不同质量浓度大豆异黄酮在体外对褐牙鲆头肾巨噬细胞增殖活力的影响

2.1.3 对褐牙鲆头肾巨噬细胞吞噬活力的影响

当细胞培养液中大豆异黄酮质量浓度为0.5 mg/mL和1.0 mg/mL时，褐牙鲆头肾巨噬细胞吞噬活力显著高于对照组和其他处理组(P<0.05)，质量浓度在0.5 mg/mL时值最高；而当细胞培养液中大豆异黄酮质量浓度为2.0 mg/mL时，褐牙鲆巨噬细胞的吞噬活力值最低(P<0.05)(图3)。

2.2 不同质量浓度大豆异黄酮在体外对褐牙鲆外周血白细胞免疫力的影响

2.2.1 对褐牙鲆外周血白细胞氧呼吸爆发活力的影响

不同质量浓度大豆异黄酮显著影响褐牙鲆外周血白细胞氧呼吸爆发活力(P<0.05)，当培养液中大豆异黄酮质量浓度为0.5、1.0 mg/mL时，白细胞氧呼吸爆发活力显著高于对照组(P<0.05)；0.1、1.5 mg/mL处理组则与对照组差异不显著(P>0.05)(图4)。

图3 不同质量浓度大豆异黄酮在体外对褐牙鲆头肾巨噬细胞吞噬活力的影响

图4 不同质量浓度大豆异黄酮下褐牙鲆外周血白细胞氧呼吸爆发活力的影响

2.2.2 对褐牙鲆外周血白细胞增殖活力的影响

培养液中添加不同质量浓度大豆异黄酮显著增强了褐牙鲆外周血白细胞的增殖活力(P<0.05)，且大豆异黄酮质量浓度为0.5 mg/mL时，白细胞增殖活力值最高(图5)。

2.2.3 对褐牙鲆外周血白细胞吞噬活力的影响

不同质量浓度大豆异黄酮显著影响了褐牙鲆外周血白细胞的吞噬活力(P<0.05)(图6)，大豆异黄酮质量浓度为0.5 mg/mL时褐牙鲆外周血白细胞吞噬活力最高，显著高于其他试验组(P<0.05)；随着培养液中大豆异黄酮质量浓度的增加，褐牙鲆外周血白细胞吞噬活力显著降低，当大豆异黄酮质量浓度为2.0 mg/mL时，白细胞吞噬活力最低，显著低于其他试验组(P<0.05)。

图5 不同质量浓度大豆异黄酮下褐牙鲆外周血白细胞的增殖活力

图6 不同质量浓度大豆异黄酮下褐牙鲆外周血白细胞的体外吞噬活力

3 讨 论

大豆异黄酮是大豆中主要的植物雌激素，是一种具有类雌激素性质的抗营养因子[7]。研究表明，动物饲粮中添加适量的大豆异黄酮能够促进动物生长，降低饲料成本，增强机体免疫力[21]。日粮中添加大豆异黄酮能够促进蛋鸡免疫器官发育，提高免疫功能[22]；大豆异黄酮显著影响了仔猪生长、免疫性能等[8]。但是，大豆异黄酮在水产动物中的研究较少，Tzchori等[23]在饲料中添加2、20 μg/g的大豆异黄酮促进了欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)的生长；张伟[7]研究发现，当饲料中大豆异黄酮含量在4800 μg/g以下时，对异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)的生长无显著影响，而当含量超过7200 μg/g时，则显著抑制异育银鲫的生长。在本试验中，离体条件下大豆异黄酮显著影响褐牙鲆头肾巨噬细胞和外周血白细胞的免疫力。培养液中大豆异黄酮的质量浓度为0.5 mg/mL时，显著促进了褐牙鲆相关免疫活力；但大豆异黄酮质量浓度进一步增加，褐牙鲆的免疫力反而下降，在本试验条件下，当大豆异黄酮质量浓度为2.0 mg/mL时，褐牙鲆的细胞呼吸爆发活力、巨噬细胞增殖活力和吞噬活力降低，培养液中高质量浓度的大豆异黄酮对褐牙鲆的细胞免疫力表现出抑制作用。

头肾巨噬细胞和外周血白细胞均属于鱼类主要的吞噬细胞，其对免疫的影响主要体现在呼吸爆发活力、增殖活力和吞噬活力。颗粒与吞噬细胞的结合或其它可溶性物质的刺激可以激发吞噬细胞产生大量的活性氧[超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)和单线态氧(1O2)等]。这些活性氧杀灭细菌和微生物的过程即为呼吸爆发[24]。在本试验中，大豆异黄酮在体外增强了头肾巨噬细胞和外周血白细胞氧呼吸爆发活力，增强效果随质量浓度的增加先升后降。Disilvestro等[25]曾报道大豆异黄酮可以提高人体红细胞内超氧化物歧化酶的活性；Zhou等[6]研究也表明，添加大豆异黄酮改善了机体抗氧化状态，抑制自由基的形成，从而减少脂质超氧化物的形成。因此大豆异黄酮对细胞呼吸爆发活力的影响可能主要体现在对细胞内氧自由基的产生上。但大豆异黄酮对呼吸爆发活力的影响有一个阈值，当添加量超过一定值则产生抑制作用。吞噬细胞为鱼体内主要的免疫细胞，外来微生物入侵后即开始增殖以杀死外来入侵微生物[26]；吞噬作用是细胞内消化、杀灭和消化入侵的微生物过程，这包括了颗粒与细胞表面接触、消化形成吞噬体以及分解吞噬体中的颗粒三个步骤[27]。本试验结果表明，大豆异黄酮显著影响头肾巨噬细胞和外周血白细胞的增殖活力及吞噬活力。Tang等[28]发现，异黄酮衍生物可以通过抑制巨噬细胞和骨髓基质细胞中相关蛋白的信号通路，抑制破骨细胞的形成，可以推论大豆异黄酮可以通过介导与细胞增殖和吞噬作用相关的蛋白表达来影响其活力，或者是通过影响细胞内信号通路的完成来影响巨噬细胞和白细胞的增殖活力。

本试验在离体条件下，在培养液中添加大豆异黄酮培养巨噬细胞和白细胞，显示添加不同质量浓度的大豆异黄酮对褐牙鲆头肾巨噬细胞和外周血白细胞的免疫效果具有显著影响，推测存在一个促进鱼类生长的适宜大豆异黄酮质量浓度，为进一步在饲料中添加大豆异黄酮，促进动物免疫的研究提供了参考。但饲料中大豆异黄酮的影响受机体更为复杂的调控机制作用，也与鱼的种类、规格、性别、食性、生理状态、养殖系统等多种因素影响，其作用效果和机理有待于进一步探讨。

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