基于生存分析的三疣梭子蟹无水保活技术研究

尚海涛，俞静芬，朱 麟，崔 燕，林旭东，凌建刚

( 1.宁波市农业科学研究院，农产品加工研究所，浙江 宁波 315040；2.宁波市农产品保鲜工程重点实验室，浙江 宁波 315040 )

梭子蟹(Portunus)(俗称白蟹、枪蟹、飞蟹)是我国大型海洋经济蟹类，是沿海重要的渔业资源[1]。三疣梭子蟹(P.trituberculatus)肉质细嫩、脂膏肥满、味道鲜美、营养丰富，是海中珍品，可蒸、煎、炒，亦可葱油、汤类，还可鲜食、腌食等。传统的梭子蟹运输方法有有水保活法(活水运输)、冰鲜法(加冰运输)、冷冻法等。无水保活，又称离水保活，或称干法运输，是对传统运输方法的一次革新，具有低成本、低污染、方便实用等优点。研究较多的有鲫鱼(Carassiusauratus)[2]、罗非鱼(Oreochromissp.)[3]、泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)[4]等鱼类，还有日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)[5]、日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)[6]等虾类，及海湾扇贝(Argopectenirradians)[7]、厚壳贻贝(Mytiluscrassitesta)[8]等贝类保活方法。

生存分析是将事件的结果(终点事件)和出现这一结果所经历的时间结合起来分析的一种统计分析方法。由于它考虑了每个观测出现某一结局的时间长短，可以更好地描述终点事件发生规律。在医学科学研究中具有广泛而重要的应用价值。近年来许多研究者更是将其应用到生态学[9]、工程学[10]、社会学[11]、经济学[12]、计算机科学[13]等领域。

笔者将梭子蟹死亡作为终点事件，研究有水充气、有水未充气、高氧、高氧低二氧化碳等处理对三疣梭子蟹生存状况的影响，应用生存分析揭示三疣梭子蟹死亡规律，探析致死原因，以期为三疣梭子蟹的无水保活技术的应用提供一定的数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

试验用三疣梭子蟹购于宁波象山中国水产城。海水晶(上海保嘉工贸有限公司)；钠石灰(上海纳辉干燥试剂厂)；高纯氧气、氮气、二氧化碳(宁波市方辛气体公司)。

S-80B型增氧机(宁波横溪赛尔电器厂)；LQP-B-4制冰机(上海安亭科学仪器厂)；CheckPoint型O2/CO2气体分析仪(丹麦PBI Dansensor公司)；FG4型便携式溶解氧测定仪[梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司]；MAP-H360型盒式包装机(苏州森瑞保鲜设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理

试验蟹为海捕野生三疣梭子蟹雄蟹，捆绑螯足，规格一致(150～200 g)，活泼健康。采用有水充气的方法5 h内运回宁波市农业科学研究院农产品加工研究所实验室，再次挑选出活力强的蟹用于试验。

1.2.2 离水干露试验

将50只梭子蟹，随机分成5组，每组10只，无水干露于塑料箱中，置于8～10 ℃冷库中，每2 h观察一次，评价梭子蟹活力，记录死亡蟹个数和死亡时间。

1.2.3 有水充气试验

将50只梭子蟹，随机分成5组，每组10只，放置在8～10 ℃冷库中的有水塑料箱中(按海水晶使用方法配制)，充气增氧。每12 h观察一次，评价梭子蟹活力，并记录死亡蟹个数和死亡时间。同时，测定水体溶解氧含量，并更换水体一次。

1.2.4 有水未充气试验

处理同1.2.3，但未充气，放置在8～10 ℃冷库中，每2 h观察一次，评价梭子蟹活力，并记录死亡蟹个数和死亡时间。同时测定水体溶解氧含量。

1.2.5 加冰试验

将50只梭子蟹，随机分成5组，每组10只，无水状态下置于塑料箱中，加入碎冰(蟹冰量约为1∶1.5)，放置在8～10 ℃冷库中，每1 h观察一次，评价梭子蟹活力，记录死亡蟹个数和死亡时间。

1.2.6 高氧试验

将50只梭子蟹，以1层湿毛巾、2只蟹的方式置于包装盒内，采用盒式包装机充入80%氧气，自动热压封口。然后放置在8～10 ℃冷库中，每8 h测定包装盒内氧气和二氧化碳含量，拆封观察一次，评价梭子蟹活力，并记录死亡蟹个数和死亡时间，观察后活蟹按拆口前测定的氧气和二氧化碳含量再次充气继续试验。

1.2.7 高氧低二氧化碳试验

处理同1.2.6，只是预先在每个包装盒内放入20 g钠石灰。

1.3 测试项目与方法

1.3.1 活力评价与死亡判断标准

5人评分小组按表1对梭子蟹活力进行评价，并以0级活力作为蟹死亡判断标准。

1.3.2 溶解氧含量与氧气/二氧化碳含量测定

采用溶解氧测定仪测定水体中溶解氧含量。采用气体分析仪测定包装盒内的氧气/二氧化碳含量。

1.4 统计方法

试验结果采用SPSS 18.0软件，进行乘积极限法生存分析和Log-Rank检验，差异显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 三疣梭子蟹的生存曲线

捕捞后生存环境的变化使梭子蟹陆续死亡，其生存曲线见图1。生存分析结果表明，不同保活处理间平均生存时间存着显著性差异(P<0.05)(表2)。各处理下梭子蟹平均生存时间由长到短依次为有水充气保活(68.4 h)>高氧低二氧化碳保活(53.1 h)>高氧保活(38.4 h)>离水干露(7.6 h)>有水未充气保活(2.6 h)>加冰保活(1.8 h)。

图1 不同处理下三疣梭子蟹的生存曲线

活力值操作方法表现死亡与否4～53～42～32～31～20～10抓起梭子蟹如抓起梭子蟹未见蟹足明显伸缩轻掀蟹脐蟹足伸缩有力，频率高蟹足伸缩有力，频率中蟹足伸缩无力，频率低蟹足伸缩有力，频率高蟹足伸缩有力，频率中蟹足伸缩无力，频率低仍未见蟹足明显伸缩活蟹死蟹

表2 不同处理下三疣梭子蟹生存表的平均生存时间

注：不同字母表示差异显著，相同字母表示差异不显著，差异显著性水平为0.05.

加冰是目前市场上常用的梭子蟹运输方法之一，但由图1可见，其死亡速度最快，表明加冰运输“只保鲜不保活”。这一点主要与温度低有关。谢佳彦等[14]研究表明，梭子蟹较适宜于5 ℃干法运输。林国雄等[15]认为，温度过低、温差太大，蟹体适应不了突然的环境而产生严重断足，甚至死亡，降低成活率，建议采用梯度降温冷却麻醉处理。

2.2 有水充气和有水未充气保活

死亡是一个终点事件，只表示活力为0时的生存状态。而活力是一个过程变量，可以更好的动态描述梭子蟹生存状况和分析致死原因。有水充气保活和有水未充气保活梭子蟹活力变化上差异巨大，前者活力保持较好，后者却极差。有水充气保活可以持续保持着高活力，而有水未充气保活活力从一开始就急速下降，其下降起始时间早于平均生存时间2.6 h(图2)，说明梭子蟹活力下降继而死亡。有水充气保活却未发现类似的现象，未出现普遍活力快速下降的现象。

图2 有水保活过程中三疣梭子蟹活力变化

有水保活是目前市场上最常用的梭子蟹保活方式，但有水保活必须充气，以提供充足的溶解氧。刘重斌等[16]研究认为三疣梭子蟹有水保活生存关键的溶解氧水平为2～4 mg/L。0、10、20 ℃的水中饱和溶解氧分别为14.64、11.26、9.08 mg/L，实际天然水中氧气含量达不到上述饱和量。有水未充气起始点溶解氧仅8 mg/L。随着梭子蟹呼吸消耗氧气，溶解氧会迅速下降。有水充气保活溶解氧含量一直保持在9～11 mg/L(图3)，充足的氧气避免了低氧胁迫和活力下降。可见，溶解氧在有水保活中起着至关重要的作用。

图3 有水保活过程中水体溶解氧含量的变化

2.3 离水干露

梭子蟹离水后前4 h活力变化较为平稳，仅略微下降，类似于有水充气保活，但4 h后，活力快速下降，活力变化又类似于有水未充气保活。离水干露平均生存时间7.6 h，活力下降之后陆续死亡(图4)。

梭子蟹靠鳃呼吸，虽然空气中的氧气含量21%(合300 mg/L)，远高于水中的溶解氧含量，但梭子蟹无法直接利用空气中的氧气。氧气必须先溶解于水中(或鳃体水中)，再由蟹鳃呼吸利用。离水后蟹鳃中仍保留一定的水分，一定时间内仍可提供氧气，确保梭子蟹呼吸顺畅。但鳃体中水分与有水保活量上的巨大差异，使得有水保活空气(氧)溶于水中的效率远不及直接溶于鳃体水中，这或许可解释为什么有水未充气保活效果不及离水干露。但随着离水干露时间的延长，蟹鳃中的水分排出，以及黏液、有机物等的附着，致使鳃丝黏着，有效氧气的交换面积下降，对氧气的有效利用减少，逐渐窒息死亡。如同有水未充气保活，离水干露后期导致低氧胁迫阻碍机体代谢能力，呼吸受阻，最终窒息死亡[17]。

图4 离水干露过程中三疣梭子蟹活力变化

2.4 高氧保活

由图1、表2可见，高氧保活平均生存时间(38.4 h)显著高于离水干露(7.6 h)，活力快速下降的起始点(16 h)也远晚于离水干露(4 h)，表明高含量氧气有利于梭子蟹的保活。这一点与何蓉等[18]的研究结果相一致，他们认为充足的氧气供应是保活运输的前提。高氧有利于保持梭子蟹较高的活力和存活率，也从另一方面反映出梭子蟹离水后死亡与低氧胁迫有关。根据亨利定律高氧增加了氧分压，意味着蟹鳃中可以溶解更多的氧气。空气中氧气含量为21%，高氧保活为80%，如离水干露的梭子蟹鳃中溶解氧为8 mg/L，高氧环境理论上溶解氧应为30 mg/L，很大程度上可抵消低氧胁迫。

但是高氧保活后期还是发生了活力快速下降和死亡的现象(图5)。由包装盒内气体成分分析可知(图6)，随着保活时间的延长，包装盒内的二氧化碳含量会持续上升。16 h后，二氧化碳含量达到3.5%时，活力开始快速下降。推测梭子蟹无水保活过程中不仅存在低氧胁迫，还存在高二氧化碳胁迫。

2.5 高氧低二氧化碳保活

高氧低二氧化碳保活56 h后活力快速下降，比高氧保活又延长了40 h(图7)。相对于平均生存时间53.1 h，也要晚2.9 h，表明死亡前未发生活力普遍下降的现象。其活力表现类似于有水充气保活，而不同于离水干露、有水未充气保活和高氧保活。相对于高氧保活，高氧低二氧化碳保活过程中CO2含量一直维持在极低的水平(图8)，避免了高二氧化碳胁迫，提高了保活效果。

图5 高氧保活过程中三疣梭子蟹活力变化

图6 高氧保活过程中氧气/二氧化碳含量变化

图7 高氧低二氧化碳保活过程中三疣梭子蟹活力变化

图8 高氧低二氧化碳保活过程中氧气/二氧化碳含量变化

3 讨 论

3.1 低氧胁迫致死

梭子蟹靠鳃呼吸，离水后鳃间仍保留一定的水分，短时间内可提供充足的溶解氧供其正常呼吸，保持高活力和高存活率。但随着离水时间的延长，一方面，伴随着梭子蟹呼吸会不断往体外排出水分，可利用的总溶解氧含量下降，另一方面由于黏液和有机物附着鳃丝致使有效氧交换面积下降，使梭子蟹呼吸窒息点逐渐上升而活力下降继而死亡。这一现象被称为低氧胁迫、或低氧窒息、或干露胁迫等。而低氧胁迫会导致内脏损伤，如程民杰等[19]研究表明离水操作可能损伤了红鳍东方鲀(Takifugurubripes)的肝脏和肾脏，打破了体内的平衡机制，代谢紊乱。姜娜等[17]发现，干露胁迫导致三疣梭子蟹肝胰腺总抗氧化能力水平显著下降。高氧保活可以延长梭子蟹无水保活时间，主要是通过提高梭子蟹鳃中溶解氧含量，抵消离水干露窒息点上升而产生的低氧胁迫，以达到保活的效果。

3.2 高二氧化碳胁迫致死

高氧环境采用的密封包装下还存在高二氧化碳胁迫，高含量二氧化碳加速梭子蟹活力下降继而死亡。这一研究发现与King等[20]的有水保活研究结果相类似，他们认为鱼在有水保活运输中，需要特别关注二氧化碳含量，高于80 mg/L就会导致高碳酸血症，呼吸障碍，昏迷，最终死亡。正常代谢活动所允许的最高二氧化碳含量为20～30 mg/L。高二氧化碳含量时，不论含氧量是否充足，鱼体基本上仍处于昏迷死亡状态[21]。目前还未见梭子蟹无水状态二氧化碳胁迫阈值的报道。当水面二氧化碳分压力为0.098 MPa时，0、10、20 ℃的水中二氧化碳饱和溶解量分别为3350、2310、1690 mg/L，由于空气中二氧化碳含量仅约0.03% (260 mg/L)，与大气二氧化碳相平衡，10 ℃时，水中二氧化碳仅为0.693 mg/L(2310×0.03%)。以80 mg/L计算，对应的空气中的二氧化碳含量为3.5%(80/2310)，而此含量时高氧保活梭子蟹活力开始快速下降，继而死亡(图6)。采用高氧低二氧化碳保活避免了低氧和高二氧化碳胁迫，是一种有效的无水保活方法。

低二氧化碳含量对梭子蟹活力无影响，超过伤害阈值的高二氧化碳含量会致死。而介于两者之间的二氧化碳含量使梭子蟹休眠。目前有关鱼类二氧化碳麻醉休眠正是利用这一特性，如二氧化碳麻醉休眠罗非鱼[22]、鲫鱼[23]、白斑狗鱼[24](Esoxlucius)等，可以延长保活时间。

3.3 其他致死因素

适宜低温有利于梭子蟹无水保活，但过低温度或温度骤降(如加冰)会产生低温胁迫导致梭子蟹死亡。这一结果与彭婷等[25]认为低温胁迫致罗非鱼昏迷及死亡的结果相类似。梭子蟹在低氧、高二氧化碳、低温胁迫下死亡，其致死前活力普遍下降。而有水充气保活和高氧低二氧化碳保活，避免了胁迫因素，保活时间相对较长，但仍然有限。随着时间延长仍然会陆续死亡，其平均生存时间在活力快速下降之前，甚至不会出现活力快速下降的现象。因此，可推测梭子蟹还存在着其他致死因素，有待进一步研究。

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