志贺氏菌检测和分群PCR方法的建立

王海艳，赵治国，催 强，郭文秀，陈宇飞，赵林立

（内蒙古出入境检验检疫局，内蒙古呼和浩特 010020）

志贺氏菌对许多国家和地区的人类健康造成了严重危害。特别在不发达国家和发展中国家，由于缺乏清洁的水源和必要的卫生医疗设备等，由其引发的公共卫生问题更加严重[1-2]。大多数志贺氏菌病由3种志贺氏菌引起，即福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌和痢疾志贺氏菌。近年来，由于多种耐药志贺氏菌株的出现，许多国家和地区的志贺氏菌病病例数量不断增加。志贺氏菌病的早期确诊需要准确、快速的检测方法。目前，对志贺氏菌的鉴定分群仍然依靠常规生化鉴定方法、免疫学方法。但这些方法复杂、耗时、耗力、敏感性低。一些学者研究建立了针对志贺氏菌属的分子生物学检测技术，这些传统PCR方法存在一定的局限性，容易出现误检或漏检。因此，建立一种准确、可靠、快捷的志贺氏菌鉴定和分群方法尤为重要。

本研究根据志贺氏菌的独特基因，设计引物进行PCR分析。设计的引物用于检测志贺氏菌属，同时对临床上与志贺氏菌病有关的3种志贺氏菌（即福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌和痢疾志贺氏菌）进行分群，以弥补目前志贺氏菌分子生物学检测方法的不足。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1引物 根据志贺氏菌invC、rfc、wbgZ和rfpB 等基因，利用引物在线设计网站（http∶//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）分别设计的引物，用于鉴定志贺氏菌属、福氏志贺氏菌、宋内志贺菌和痢疾志贺菌，并以根据ompA基因设计的引物为参照。引物由上海奥吉生物技术有限公司合成（表1）。

1.1.2主要试剂 志贺氏菌增菌肉汤、志贺氏菌显色培养基：购于北京陆桥公司；Tris Base、EDTA、溶菌酶、异硫氰酸胍、sarkosyl、 Taq酶、dNTPs、PCR缓冲液、溴化乙锭、分子量100 bp DNA Ladder Marker（100～1 500 bp）：购自大连宝生物公司；低熔点琼脂糖（电泳级）和其它试剂：国产分析纯。

1.1.3主要仪器设备 低温冷冻高速离心机、微量移液器、PCR仪、电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、恒温培养箱等。

1.1.4菌株 福氏志贺氏菌株（CMCC51571、CMCC51572、ATCC12022、CMCC51579、CMCC51240），鲍氏志贺氏菌株（CMCC51346、CMCC51585、CMCC51586、ATCC9207），宋内志贺氏 菌 株（CMCC51592、ATCC11060、ATCC29930、ATCC25931、CMCC51334），痢 疾 志 贺 氏 菌 株（CMCC51105、CMCC51570、CMCC51252）， 单增李斯特氏菌CMCC54002株，英诺克李斯特氏菌ATCC33090株，威氏李斯特氏菌ATCC35897株，斯氏李斯特氏菌ATCC35967株，格氏李斯特氏菌ATCC25401株，枯草芽孢杆菌CMCC63501-21株，大肠杆菌CMCC44116株，沙门氏菌CMCC50079株，金黄色葡萄球菌CMCC26001株，乙型溶血型链球菌CMCC32210株，肺炎克雷白氏菌CMCC46114株，弗氏柠檬酸杆菌CMCC48001株，阪崎肠杆菌ATCC29544株，蜡样芽孢杆菌CMCC63303株，阴沟肠杆菌ATCC13047株，绿脓杆菌ATCC27853株，小肠结肠耶尔森氏菌ATCC23715株，绵羊李斯特氏菌ATCC19119，大肠杆菌O157∶H7 ATCC43895株：购自中国药品生物制品检定所和上海汉尼公司：

1.1.5样品 消毒鲜奶、雪糕、酸奶、香肠、熟肉和生肉：购于超市；原奶：购于个体养牛场；奶粉：送检样品。

1.2 方法

1.2.1PCR特异性检测

1.2.1.1细菌培养 将所有细菌接种于TSB-YE中，37 ℃培养1 d。分别取1.5 mL细菌培养液，8 000 r/min离心5 min，弃上清，将沉淀用0.5 mL TE 洗1次，然后直接用于DNA提取或存于−20 ℃备用。

1.2.1.2DNA提取 参照Pitcher等[3]方法进行。将沉淀干燥后用60～70 µL灭菌双蒸水溶解，将其直接用于PCR或存于−20 ℃冰箱中备用。

表1 本研究所用的引物

1.2.1.3PCR扩增 以提取的细菌DNA为模板，分别用各对引物进行PCR扩增。反应体系均为 25 µL：模板 DNA 2 µL，EX Taq DNA 聚合酶（5 U/µL）0.25 µL，10×EX Taq Buffer 2.5 µL，dNTP混合物（2.5 mmol/L）各1 µL，上游引物（10 pmol/ µL）1 µL，下游引物（10 pmol/ µL）1 µL，灭菌蒸馏水17.25 µL；循环参数：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，gen、flex和ctr引物65 ℃（son引物67 ℃，dys引物63 ℃）退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃终延伸3 min；用3%琼脂糖凝胶电泳后分析结果。

1.2.2PCR敏感性试验

1.2.2.1细菌定量接种与培养 按1～3、12、27、53、105 cfu/（25 g·mL-1）的量，将各株志贺氏菌分别接种到加入25 mL灭菌生理盐水的225 mL 志贺氏菌增菌肉汤中（接菌的同时用志贺氏菌显色培养基平板计数），并设未加菌的阴性对照，于41.5 ℃，厌氧培养18 h；各取1 mL培养物，8 000 r/min离心5 min；将沉淀用0.5 mL TE 缓冲液（pH 8. 0）悬起，移入1.5 mL离心管中，8 000 r/min离心5 min；弃尽上清后，直接用于DNA提取或存于−20 ℃冰箱中备用。

1.2.2.2DNA提取 方法同 1.2.1.2。

1.2.2.3PCR扩增 方法同1.2.1.3。

1.2.3抗干扰试验 将志贺氏菌与非志贺氏菌属细菌（乙型溶血性链球菌）混合物按相应接种量，分别接种志贺氏菌增菌肉汤（接菌的同时用志贺氏菌显色培养基平板计数）。按照1.2.2的方法进行培养、核酸提取和PCR扩增试验，同时采用传统培养法（GB 4789.5）作对比试验。

1.2.4人工接种样品验证试验 将消毒鲜奶、雪糕、酸奶、香肠、熟肉、生肉、原奶和奶粉，各取5个样，经常规方法检验无志贺氏菌污染后，用作PCR检测方法的人工接种试验。每个样取25 g/mL加入到225 mL志贺氏菌增菌肉汤中；均质后，按相应细菌量进行人工接种试验，并按1.2.2中的方法进行转接、培养、DNA提取及PCR扩增；同时将增菌肉汤划线接种于志贺氏菌显色培养基平板进行分离培养，挑取可疑菌落进行PCR鉴定；采用ISO的传统培养法作对比试验。

1.2.5实际样品检测 对本实验室送检的和市场上购买的1 100份样品进行检测，并与ISO的传统培养法进行比较。

2 结果

2.1 PCR特异性确定

引物genF/genR，除了非志贺氏菌属细菌外，在所有志贺氏菌属细菌中都扩增出了878 bp的特异性片段（图1-A）；引物flexF/flexR，仅在福氏志贺氏菌扩增出539 bp片段，其它志贺氏菌属细菌和非志贺氏菌属细菌均未扩增出相应大小片段（图1-B）；引物sonF/sonR，仅在宋内志贺氏菌可扩增出434 bp片段，其它志贺氏菌属细菌和非志贺氏菌属细菌均未扩增出相应大小片段（图1-C）；引物dysF/dysR，仅在痢疾志贺氏菌可扩增出214 bp片段，其它志贺氏菌属细菌和非志贺氏菌属细菌均未扩增出相应大小片段（图1-D）；引物ctrF/ctrR，在所有细菌中均能够扩增出1 322 bp的特异性片段（图1-E）。

2.2 PCR敏感性检测

以生理盐水替代食品，分别将福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌和痢疾志贺氏菌定量接种于志贺氏菌增菌肉汤中，两步增菌后进行PCR检测，可见增菌后 PCR 的最低检出限为 1～3 cfu/（25 g·mL-1），证明该PCR方法具有极高的敏感性（图2）。

2.3 抗干扰试验

通过试验可见，在人工污染干扰菌的情况下，本试验建立的PCR方法和培养法均可检出志贺氏菌，但培养法比较费力。在非志贺氏菌属细菌存在的情况下，由于在增菌肉汤中加入了抑菌剂，使得非志贺氏菌属细菌的生长受到抑制，所以采用两种方法均比较容易检出目标菌（表2）。

表2 志贺氏菌抗乙型溶血性链球菌干扰的试验结果

图1 不同引物PCR扩增结果

图2 PCR敏感性检测结果

2.4 人工污染食品中志贺氏菌的检出情况

将人工污染样品于41.5 ℃18 h增菌后的增菌肉汤直接进行PCR分析，发现在消毒奶、冰淇淋、酸奶、奶酪、熟肉和香肠中的志贺氏菌检出限为1～3 cfu/（25 g·mL-1），在原奶、生肉和奶粉中的检出限分别为≤ 12、27 和≤ 27 cfu/（25 g·mL-1）。将增菌肉汤划线接种于固体培养基分离培养后再进行PCR分析，发现在所有检样中均能检测到志贺氏菌，与GB4789.5传统培养法的检测限一致，均达到了1～3 cfu/（25 g·mL-1），证明该 PCR 方法适合不同类型样品的常规检测分析（表3）。

2.5 实际样品检测

对本实验室送检的1 100份样品进行检测，并与传统培养法（GB 4789.5）进行比较，均未分离到志贺氏菌，与GB4789.5的传统培养法的检测结果一致。

3 讨论

目前，国内外有许多研究者建立了食品中志贺氏菌属的PCR检测方法，如国外Houng等[4]建立的志贺氏菌属的PCR检测方法。但其建立的方法因存在一定的局限性而出现错检或漏检。在我国，许龙岩等[5]、蔡亦红[6]等建立的食品中PCR检测方法均只能鉴定志贺氏菌属。并且上述传统的PCR方法通常选择侵袭质粒（ipaH）基因、O抗原合成基因和16S基因作为目标基因，因而检测通常是基于序列的多态性或序列差别，而不是基于基因序列的缺失或存在。本研究根据志贺氏菌独特的基因设计引物进行PCR分析，将设计的引物用于检测志贺氏菌属，同时对临床上重要的志贺氏菌（即福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌和痢疾志贺氏菌）进行区分。

一个新的方法在实验室应用之前，必须与得到认可的方法进行对比，从而得到确证。本研究通过细菌干扰试验将本室建立的PCR方法与传统培养法进行对比，发现该PCR方法与传统培养法具有相同的检出水平，但PCR方法更省时、方便、快捷。

为了提高检测的灵敏性，在PCR检测前，增加了增菌步骤。其优点在于：使损伤的细胞得以修复，使细胞的数量增加；稀释样品中的抑制剂及死细胞，从而避免出现假阴性或假阳性，增加检测的灵敏度，提高检测的可靠性。

表3 人工污染样品中志贺氏菌的的检出情况 单位：份

4 结论

本研究表明，经过增菌之后，直接对增菌肉汤进行PCR检测，在其它杂菌污染轻微的食品中，检测的灵敏度可达 1～3 cfu/（25 g·mL-1），即使在有大量杂菌干扰的原奶、生肉和奶粉中，检测限也分别达到了≤ 12、27和≤ 27 cfu/（25 g·mL-1）。因此，增菌步骤对提高检测的灵敏度十分必要。另外，将增菌肉汤划线接种于固体培养基分离培养后对可疑菌落再进行PCR鉴定，发现在所有检样中均能检测到志贺氏菌，与GB4789.5的传统培养法的检测限一致，均达到了 1～3 cfu/（25 g·mL-1），说明该方法的检测灵敏度与传统培养法相同，可用于样品中志贺氏菌的常规检测分析。

[1] BENNISH M L，WOJTYNIAK B J. Mortality due to shigellosis：community and hospital data[J]. Reviews of infectious diseases，1991，13：245-251.

[2] NIYOGI S K. Shigellosis[J]. Journal of microbiology，2005，43：133-143.

[3] PITCHER D G，SAUNDERS N A，OWEN R J. Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocynate[J]. Letters in applied microbiology，1989，8：151.

[4] HOUNG H S H，SETHABUTR O，ECHEVERRIA P. A simple polymerase chain reaction technique to detect and differentiate Shigella and enteroinvasive Escherichia coli in human feces[J]. Diagnostic microbiology and infectious disease，1997，28：19-25.

[5] 许龙岩，李志勇，王志强，等. PCR 方法检测志贺氏菌的研究[J]. 检验检疫科学，2003，13（5）：28-29.

[6] 蔡亦红. PCR 快速检测食品中志贺氏菌方法的建立[J].中国人兽共患病学报，2008，24（2）：150-153.