黄芪多糖对小鼠免疫功能的药理学实验研究

2018-03-08范文彤

中国当代医药 2018年3期

范文彤

[摘要]目的考察黃芪多糖多次给药（14～17 d）对小鼠体液、细胞和非特异性免疫功能的影响。方法选取雄性昆明种小鼠作为研究对象，按体重随机分为8组，分别为空白对照组（考虑到纤维素本身也是多糖，为了排除其作用，特设空白组对照，下同）、正常对照组、模型组、灵芝多糖1000 mg/kg、黄芪多糖125、250、500、1000 mg/kg剂量组，每组12只，每天早8：00禁食，下午14：00根据体重灌胃给药，给药量为0.4 ml/20 g，空白组不给药或溶媒，正常和模型组给予同体积的0.5%的CMC，给药2 h后按3 g/只动物的量喂食。共给药15 d，于给药第10 天除空白和正常对照组外其余所有小鼠右侧腋部均接种S180荷瘤细胞，于末次给药24 h后小鼠眼眶取血，分离血清，将血清稀释3倍后测定IgG沉淀环直径，与标准IgG相对照，计算样品中IgG的相对含量，试验结果进行统计学处理。结果黄芪多糖125、250、500和1000 mg/kg能明显增加环磷酰胺和荷瘤所致免疫低下小鼠的血清IgG含量。黄芪多糖500 mg/kg和1000 mg/kg能明显增加放射损伤的小鼠血清IgG含量；2，4-二硝基氟苯皮肤接触致敏后，1周左右再次接触可以引起T细胞介导的迟发性变态反应，黄芪多糖250 mg/kg和500 mg/kg可增加2，4-二硝基氟苯引起的正常小鼠的迟发性变态反应，黄芪多糖125 mg/kg和500 mg/kg可增加2，4-二硝基氟苯引起的环磷酰胺所致免疫低下小鼠的迟发性变态反应；黄芪多糖250 mg/kg和500 mg/kg能明显恢复环磷酰胺所致免疫低下小鼠的吞噬细胞功能，500 mg/kg可使小鼠碳廓清指数K和吞噬指数α显著增加。结论黄芪多糖具有明显增加体液免疫的功能，对T淋巴系免疫细胞的功能有一定的促进作用，且能显著提高小鼠的非特异性免疫功能。

[关键词]黄芪多糖；非特异性免疫；体液免疫；环磷酰胺

[中图分类号] R543.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）1（c）-0010-05

Experimental research on the pharmacological effects of astragalus polysaccharide on immune function in mice

FAN Wen-tong

Tianjin Huairen Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tianjin 300385，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of astragalus polysaccharide in multiple administrations on humoral，cellular，and nonspecific immune function in mice from day 14 to 17.Methods Male Kunming mice were selected as the subjects，and randomly divided into 8 groups：blank control group （taking into account that the cellulose itself also belongs to polysaccharide，and blank control group was set in order to exclude its impact），normal control group，model group，1000 mg/kg Ganodermalucidum polysaccharide group，and groups of Astragalus polysaccharide in doses of 125 mg/kg，250 mg/kg，500 mg/kg and 1000 mg/kg.There were 12 animals in each group.Each day，8：00 was for fasting，and 14：00 for intragastric administration based on the weight （0.4 ml/20 g）.There was no drug or menstruum in the blank control group.In the normal and model groups，same volume of 0.5% CMC was offered.After 2-hour medication，food was provided with 3 g each mouse.The medication was lasted for 15 days.In day 10 of administration，S180 tumor-bearing cells were inoculated to the right axilla in mice except blank and normal control groups.24 hour after medication，blood was collected from eye socket，and serum was separated.The serum was diluted in 3 times to determine the diameter of IgG precipitation ring.By reference of the standard IgG，the relative content of IgG in the sample was calculated.The experimental results were statistically analyzed.Results Astragalus polysaccharide in 125，250，500 mg/kg，and 1000 mg/kg could significantly increase the serum IgG content in the immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide and tumorbearing.Astragalus polysaccharide in 500 mg/kg and 1000 mg/kg greatly increased the content of serum IgG in irradiated mice.After skin allergy due to exposure to 2，4-dinitrofluorobenzene，the delayed allergic reaction mediated by T cells could be induced by repeated skin contact about one week.Astragalus polysaccharide in 250 mg/kg and 500 mg/kg could increase delayed allergic reaction in normal mice induced by 2，4-dinitrofluorobenzene.If in 125 mg/kg and 500 mg/kg， astragalus polysaccharidecould increase the delayed allergic reaction in immunosuppressive miceinduced by cyclophosphamide which was from 2，4-dinitrofluorobenzene.Astragalus polysaccharide in 250 mg/kg and 500 mg/kg could obviously restore the phagocytic function in immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide，and 500 mg/kg could markedly raise the carbon clearance index K and phagocytic index α in mice.Conclusion It is indicated that thatastragalus polysaccharide has the function of increasing humoral immunity，promotes the function of T-lymphocyte immune cells，and can significantly improve the nonspecific immune function in mice.endprint

[Key words]Astragaluspolysaccharide；Nonspecificimmunity；Humoralimmunity；Cyclophosphamide

黄芪，又名绵芪[1]。多年生草本，高50～100 cm。主根肥厚，木质，常分枝，灰白色。茎直立，上部多分枝，有细棱，被白色柔毛。黄芪多糖是从黄芪的干燥根经提取、浓缩、纯化而成的水溶性杂多糖，淡黄色，粉末细腻，均匀无杂质，具引湿性；其由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等组成，可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用[2]。本研究考察了黄芪多糖多次给药（14～17 d）对小鼠免疫功能的影响[3]，旨在为临床研究提供参考，现报道如下。

1对象与方法

1.1试验动物

雄性昆明种小鼠由天津药物研究院动物室繁殖，试验动物设施合格证为“津试验动物设施第013号”，由天津市试验动物管理委员会颁发，符合一级标准，动物正常饲养3 d后供用。

1.2主要试剂与仪器

1.2.1主要试剂

1.2.1.1受试药物 ①黄芪多糖为供试品：淡黄色粉末，由天津中新药业集团天津中新制药厂提供，含量为70%，产品批号为050609。临用前以0.9%的羧甲基纤维素（CMC）或5%聚维酮（PVP）配制成适当浓度的混悬液。②灵芝多糖为阳性对照药，市售品，陕西省昂盛医药生物科技有限公司产品，产品批号为20160307。

1.2.1.2试剂 ①环磷酰胺（Cy）：白色粉末，上海研生医药股份有限公司购入，产品批号为2016060。②抗小鼠IgG血清：中国药品生物制品检定所购入，产品批号为20160609。

1.2.1.3培养基 ①M-H培养基（琼脂）：pH为7.4±0.2，由中国药品生物制品检定所生产，产品批号为20160619。②M-H培养基（肉汤）：pH为7.4±0.2，由中国药品生物制品检定所生产，产品批号为20160620。

1.2.1.4菌种 ①绿脓假单胞菌：中国药品生物制品检定所购入，产品批号为20160725。②萄球菌（临床菌）：天津医科大学总医院购入，产品批号为20160725。③流感病毒（A/PR/8/34）：中国预防医学科学院病毒所流感室购入，产品批号为20160725。

1.2.2仪器

YSQG02型电热式蒸汽消毒器（无锡建仪实验器材有限公司），TJ型洁净工作台（天津市净化设备厂），HZQ-D水浴振荡器（常州市国旺仪器制造有限公司）。

1.3试验分组及模型制备

1.3.1黄芪多糖对体液免疫功能的影响[4]

选取96只体重为18～22 g的雄性昆明种小鼠，按体重随机分为8组，分别为空白对照组（考虑到纤维素本身也是多糖，为了排除其作用，特设空白组对照，下同）、正常对照组、模型组、灵芝多糖1000 mg/kg、黄芪多糖125、250、500和1000 mg/kg剂量组，每组12只，每天早8：00禁食，下午2：00根据体重灌胃给药，给药量为0.4 ml/20 g，空白组不给药或溶媒，正常和模型组给予同体积的0.5%的CMC，给药2 h后按3 g/只动物的量喂食。

1.3.2黄芪多糖对细胞免疫、非特异性免疫功能的影响[5-7]

选取141只体重为20～24 g的雄性昆明种小鼠，依照体重分为7组，每组12～22只，分别为空白对照组、正常对照组、模型组（Cy模型）、阳性对照组（灵芝多糖1 g/kg）、黄芪多糖125、250、500 mg/kg剂量组。

选取72只体重为20～24 g的雄性昆明种小鼠，依照体重随机分为6组，每组12只，分别为空白对照组、正常对照组、阳性对照组（灵芝多糖1 g/kg）、黄芪多糖125、250、500 mg/kg剂量组。

选取129只体重为20～24 g的雄性昆明种小鼠，依照体重随机分为6组，每组20～22只，分别为正常对照组、模型组（Cy模型）、阳性对照组（灵芝多糖1 g/kg）、黄芪多糖125、250、500 mg/kg剂量组。

选取60只体重为20～24 g的雄性昆明种小鼠，依照体重随机分为5组，每组12只，分别为正常对照组、阳性对照组（灵芝多糖1 g/kg）、黄芪多糖125、250、500 mg/kg剂量组。

各组小鼠灌胃给药，1次/d，连续14 d，药物用3%PVP溶解。每天早上8：30禁食，于下午2：30～3：00根据体重灌胃给药，灌胃体积为0.4 ml/20 g，给药后2 h，按3 g/只动物进食量给饲料。空白、正常对照组分别给予同体积的空白溶媒。

1.4观测指标及检测方法

1.4.1 IgG含量的影响

给药15 d，于给药第10天除空白和正常对照组外其余所有小鼠右侧腋部均接种S180荷瘤细胞，于末次给药24 h后小鼠眼眶取血，分离血清，将血清稀释3倍测定IgG沉淀环的直径，以标准IgG相对照，计算样品中IgG的相对含量。

1.4.2对放射损伤小鼠血清IgG含量的影响

给药17 d，于给药第8天除空白和正常对照组外给于其余所有小鼠1次照射铯源，剂量为3.0 Gy，于末次给药24 h后小鼠眼眶取血，分离血清，将血清稀释3倍后测定IgG沉淀环的直径，以标准IgG相对照，计算样品中IgG的相对含量。

1.4.3對Cy所致免疫低下小鼠血清IgG含量的影响

给药15 d，于给药第6 天除空白和正常对照组外给于其余所有小鼠皮下1次注射Cy 100 mg/kg造模，末次给药24 h后小鼠眼眶取血，分离血清，将血清稀释3倍测定IgG沉淀环的直径，以标准IgG相对照，计算样品中IgG的相对含量。endprint

1.4.4 Cy所致免疫低下小鼠T细胞介导的迟发性过敏反应（DTH）的影响[6]

第8天除空白对照组外，各组小鼠腹部去毛（面积约3×3 cm），用1% 2，4-二硝基氟苯（DNFB）的丙酮-麻油溶液涂抹腹部致敏，每鼠50 μl，并在致敏后2 h腹腔注射Cy 80 mg/kg造免疫低下模型，次日加强致敏并注射1次同剂量的同剂量Cy，于第13天用1%DNFB丙酮-麻油溶液10 μl均匀涂抹在小鼠右耳部攻击，攻击后24 h将小鼠称重，造成迟发性变态反应（DTH），随后处死动物，剪两侧耳壳，用打孔器打直径6 mm的片，称重测定，比较两侧耳片重量差值的差别。

1.4.5对正常小鼠DTH反应的影响

用两侧耳片重量的差值作为肿胀度指标，比较各组小鼠耳片肿胀度的差别，观察黄芪多糖对正常小鼠DNFB所致DTH反应的影响。

1.4.6对Cy[8]所致免疫低下小鼠碳粒廓清的影响

第8天除对照组外，腹腔注射Cy 80 mg/kg造免疫低下模型，次日再注射1次同剂量Cy，于第15天小鼠尾静脉注射25%印度墨汁0.1 ml/10 g，分别于1 min（t1）和5 min（t2）取血20 μl，加入2 ml 0.1%Na2CO3溶液中，振荡混匀，680 nm波长比色测定，并取肝脏和脾脏加以称重，计算各剂量组小鼠碳廓清指数K和吞噬指数α。碳廓清指数K=（LogOD1-LogOD2）/（t2-t1）；吞噬指数α=（K）1/3×体重/（肝和脾重）。

1.4.7对正常小鼠碳廓清的影响

第15天小鼠尾静脉注射25%印度墨汁0.1 ml/10 g，分别于1 min（t1）和5 min（t2）取血20 μl，加入2 ml 0.1%Na2CO3溶液中，振荡混匀，680 nm波长比色。随后处死动物，取肝脏和脾脏加以称重，计算各剂量组小鼠碳廓清指数K和吞噬指数α。碳廓清指数K=（LogOD1-LogOD2）/（t2-t1）；吞噬指數α=（K）1/3×体重/（肝和脾重）。

1.5统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义[9]。

2结果

2.1黄芪多糖对荷瘤小鼠血清Ig G含量的影响

正常对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），Cy模型组与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），阳性对照组（灵芝多糖）与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），小鼠灌胃黄芪多糖500、1000 mg/kg与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），而与同剂量的灵芝多糖相比作用相当（表1）。

2.2黄芪多糖对放射损伤小鼠血清IgG含量的影响

正常组对照与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），Cy模型组与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），阳性对照组（灵芝多糖）与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），小鼠灌胃黄芪多糖500、1000 mg/kg与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），而与同剂量的灵芝多糖相比作用相当（表2）。

2.3黄芪多糖对Cy所致免疫低下小鼠血清IgG含量的影响

正常对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），Cy模型组与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），阳性对照组（灵芝多糖）与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），小鼠灌胃黄芪多糖500、1000 mg/kg，与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），而与同剂量的灵芝多糖相比作用相当（表3）。

2.4黄芪多糖对Cy所致免疫低下小鼠DTH反应的影响

正常对照组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），Cy模型组与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），阳性对照组（灵芝多糖）与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），小鼠灌胃黄芪多糖125、500 mg/kg，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），而与同剂量的灵芝多糖相比作用相当（表4）。

2.5黄芪多糖对DNFB致正常小鼠DTH反应的影响

正常对照组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），阳性对照组（灵芝多糖）与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），小鼠灌胃黄芪多糖250、500 mg/kg，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），且高于同剂量的灵芝多糖（表5）。

2.6黄芪多糖对Cy所致免疫低下小鼠碳粒廓清的影响

Cy模型组与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），阳性对照组（灵芝多糖）与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），小鼠灌胃黄芪多糖250、500 mg/kg，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），而与同剂量的灵芝多糖相比作用相当（表6）。

2.7黄芪多糖对正常小鼠碳粒廓清的影响

阳性对照组（灵芝多糖）与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），小鼠灌胃黄芪多糖500 mg/kg，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），而与同剂量的灵芝多糖相比作用相当（表7）。

3讨论

多糖[10]类化合物作为免疫调节剂能在多途径对免疫系统发挥免疫调节作用[11]，本研究从体液免疫[12]、细胞免疫、非特异性免疫等方面研究了黄芪多糖对机体免疫功能[13]的影响。

实验结果提示，正常对照组和空白对照组之间差异无统计学意义（P>0.05），小鼠接种S180瘤细胞后IgG含量明显低于空白对照组，体液免疫功能下降，小鼠灌胃黄芪多糖500 mg/kg和1000 mg/kg 15 d后能明显增加荷S180瘤小鼠血清IgG的含量；小鼠经放射损伤后，模型组动物血清的IgG含量明显低于正常对照组。小鼠灌胃黄芪多糖500、1000 mg/kg 17 d后能明显升高放射损伤小鼠血清的IgG含量；小鼠皮下注射1次Cy后， IgG含量明显低于正常对照组，小鼠经口灌胃黄芪多糖125、250、500、1000 mg/kg 15 d后能明显升高小鼠血清IgG的含量；与同剂量的灵芝多糖相比作用相当，提示黄芪多糖具有明显的增加体液免疫的功能。endprint

T细胞介导的DTH反应，是反应T细胞功能的指标，在不致敏的情况下，DNFB对两耳几乎没有影响，致敏后可以明显引起耳肿胀，Cy 80 mg/kg可明显抑制由DNFB诱发的DTH反应，黄芪多糖125、500 mg/kg使小鼠受抑制的DTH反应明显恢复；黄芪多糖灌胃给药14 d，可增加DNFB所致的DTH反应。其中250、500 mg/kg剂量组可显著增加小鼠耳片肿胀度，提示黄芪多糖对T淋巴系免疫细胞的功能有一定的促进作用。小鼠腹腔注射Cy 80 mg/kg×2次，可明显抑制小鼠吞噬细胞的功能，碳粒廓清指数和吞噬指数下降，黄芪多糖250 mg/kg和500 mg/kg给药14 d，能明显恢复Cy所致免疫低下小鼠的吞噬细胞功能，其中250 mg/kg剂量组与灵芝多糖500 mg/kg剂量组药效相近；黄芪多糖500 mg/kg可使正常小鼠碳廓清指数K和吞噬指数α显著增加，与阳性药灵芝多糖的作用接近，提示黄芪多糖可显著提高正常小鼠的非特异性免疫功能[14]。

黄芪多糖将作为免疫增强剂广泛应用于多种疾病术前术后的治疗、免疫力低下引起的感染以及腫瘤放化疗后的综合治疗，具有巨大的市场开发前景[15]。

[参考文献]

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