IFITM1/2/3和胃癌发生、癌细胞转移的关系

李 峥 魏 微

胃癌是临床常见的恶性消化系统肿瘤，其发生因素涉及到基因因素，例如抑癌基因变异。临床诊断标志物在研究胃癌的发生与发展中发挥着重要的作用[1-2]。干扰素诱导跨膜蛋白属于一类细胞因子，从IFN干扰素家族刺激诱导分泌出来的蛋白，其在抗增殖、抗肿瘤、抗病毒中具有重要的作用[3-4]。干扰素诱导跨膜蛋白基因和胃癌的发生与发展密切相关[5-6]。本研究目的在于探讨IFITM1/2/3和胃癌的发生、癌细胞转移的关系。

1 材料与方法

1.1 一般材料

不同的干扰素诱导跨膜蛋白，IFITM1、IFITM2、IFITM3；目的基因质粒；真核表达载体；细胞株，人体胃腺癌细胞株(SGC-7901)。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 1640培养基，链霉素，青霉素，10%胎牛血清，5%山羊血清，引物合成，PCR试剂盒，Western blot显影液，RNA提取试剂，RNA逆转录试剂盒。

1.2.2 仪器 CO2细胞培养箱、冷冻高速离心机、凝胶成像图像分析仪、凝胶扫描分析仪、凝胶图像分析系统、紫外光光栅分光光度计、恒温摇床。

1.3 检测方法

1.3.1 细胞株的培养 在含有胎牛血清的培养基中加入细胞株，温度37 ℃，CO2浓度5%，进行孵育，选择生态良好的细胞接种于6孔培养板，控制密度为3×105，再把培养板放回温箱中培养14 h。

1.3.2 RT-PCR检测IFITM基因 采用RT-PCR 的方法测定组织中IFITM-mRNA水平。取出组织1 g，提取总RNA，进行反转录。检测组织中IFITM 基因mRNA 表达。通过RT-PCR试剂盒合成cDNA，取出2 μg RNA，灭菌，摇均匀，放在65 ℃保温，5 min后，放在室温中，静置10 min，进行离心，静置在平面桌上。进行PCR扩增，从cDNA序列设计IFITM基因其引物序列，采用凝胶扫描分析仪测定DNA 电泳条带和光量子强度，IFITM-mRNA 表达水平=IFITM/G3PDH。扩增引物序列如下：IFITM1：5'-TCTTCTTGAACTGGTGCTGTC-3'；IFITM2：5'-CCTTGACCTGTATTCCACT-3'；IFITM3：5'-TCCCACGTACTCCAACTTCCA-3'。

1.3.3 Wester检测干扰素诱导蛋白表达量 在干扰素诱导蛋白中接入病毒液，48 h后，采用Western 印迹法测定血清抗IFITM的抗体反应。在菌体液中加入15 μl的SDS-PAG，电泳分离蛋白质，把PAGE胶中的蛋白质进行转移，温度4 ℃，时间2.5 h，加入PBS配置5%脱脂奶粉，进行封闭，加入TTBS 1∶50 配制患者血清10 ml 作一抗进行反应，孵育，2 h后，加入TTBS 1∶4 000配制的山羊抗人IgGHRP 10 ml 作二抗进行免疫反应，孵育1 h。采用化学发光法显示结果，可见阳性条带。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 不同干扰素诱导蛋白基因的检测结果

人体胃腺癌细胞株(SGC-7901)经过干扰素的诱导后，IFITM1、IFITM2、IFITM3的基因拷贝数都明显增加，见表1。可见干扰素诱导促使3种干扰素诱导跨膜蛋白的基因水平都得到明显的升高。由此可见，IFITM1、IFITM2、IFITM3对于胃癌肿瘤细胞转移具有抑制的作用。

表1 人体胃腺癌细胞株(SGC-7901)不同干扰素诱导蛋白基因的检测结果

2.2 IFITM1、IFITM2、IFITM3相关性

IFITM1和IFITM2呈显著正相关(γ=0.40;P=0.003)，IFITM1和IFITM3呈显著正相关(γ=0.45;P=0.001)，IFITM2和IFITM3呈显著正相关(γ=0.38;P=0.004)。见图1。

图1 IFITM1、IFITM2、IFITM3间的相关性

3 讨论

胃癌属于临床常见的消化系统恶性肿瘤，具有较高的死亡率[7]。近年来，我国手术技术和外科手术治疗策略不断改进，恶性肿瘤患者的术后生存率明显提高，但是其预后情况并没有明显的好转。相关报道显示胃癌患者术后5年生存率低于50%[8]。影响恶性肿瘤患者术后预后情况的主要原因在于术后癌细胞复发和远处转移，主要通过血管和淋巴管发生恶变[9]。干扰素家族(IFNs)广泛应用于肿瘤的治疗中，干扰素诱导跨膜蛋白生物学功能多样化，能够传导免疫细胞的信号，在细胞多种机制中发挥着不可替代的作用，例如细胞粘附、生殖细胞成熟、癌细胞生长繁殖、肿瘤发生等[10]。干扰素诱导跨膜蛋白基因家族包括IFITM1(9-27)、IFITM2(1-8D)、IFITM3(1-8U)，具有高度的同源性，落在染色体11pl5.5位置上，含有干扰素刺激反应元件，可使用Ⅰ型和Ⅱ型干扰素进行诱导，也就是IFN-a、IFN-B、IFN-y。IFITM能够调节IFN-y的抗增殖能力，其主要的作用途径为p53，通过该途径对细胞增殖产生抑制的作用，并且在细胞生长和免疫应答方面发挥着重要的作用。对p53的路径进行干扰或者阻断能够减少IFITM1的表达，从而抑制细胞的生长能力。近年来，研究发现结直肠癌、卵巢癌、自身免疫性疾病患者的干扰素诱导跨膜蛋白基因水平上调[11-12]，但是关于干扰素诱导跨膜蛋白家族在胃癌中的表达情况研究甚少，IFITM基因在胃癌中的表达情况及IFITM基因在胃癌的发生发展的相互关系尚不清楚。

本研究显示，人体胃腺癌细胞株(SGC-7901)经过干扰素的诱导后，IFITM1、IFITM2、IFITM3的基因拷贝数都明显增加，可见干扰素诱导促使3种干扰素诱导跨膜蛋白的基因水平都得到明显的升高。由此可见，IFITM1、IFITM2、IFITM3对于胃癌肿瘤细胞转移具有抑制的作用。结合相关研究结果，可见IFITM基因不仅和胃癌的发生密切相关，而且还和癌细胞的转移密切相关，其在胃癌的发生、发展、转移、侵袭过程中发挥着关键的作用。通过降低干扰素诱导蛋白在胃癌组织中的表达水平能够有效地抑制癌细胞的生长和繁殖，并且能够有效地抑制癌细胞转移和侵袭，从而为胃癌分子靶向治疗提供新的方向。同时，表2表明胃癌组3个基因表达水平呈显著正相关，可见三者相互促进表达，在胃癌的发生和发展发挥着协同作用。

综上所述，IFITM3基因在胃癌组织及胃癌细胞中高表达，且降低IFITM的表达可以抑制肿瘤细胞的侵袭和转移能力。但是，目前的研究对于该基因作用于这些肿瘤的侵袭机制及分子调控网络尚不清楚,建议进一步研究IFITM基因的作用机制，为阐明肿瘤发生和发展的分子调控网络展开新的方向。

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