微流控芯片富集鼻咽癌细胞的实验研究

陈文学 李金高 程为良 万祥辉 齐淑轶 张宇晴 翁秋敏 李俊玉 熊文敏 谢 琛

鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤之一，由于早期症状不明显，就诊时大部分已是中晚期。鼻咽癌的治疗手段主要是放射治疗，在患者进行根治性放射治疗后有40%～60%会有鼻咽部或(和)颈部复发，复发多见于放射治疗后的2～3年内。

鼻咽癌复发转移是导致死亡的直接原因。目前鼻咽癌复发转移的主要检查方法是影像学检查，只有在复发和转移的肿瘤形成一定的体积时候影像学才能够成像，此时已经失去的肿瘤治疗的最好机会。肿瘤在形成复发转移之前肿瘤细胞已经在血中播散，外周血中的这种肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞(CTC)[1]。肿瘤的负荷与血液中的CTC有直接关系，因此检测CTC可以反映肿瘤的状态。[2]

本研究采用前期筛选出的适配子结合微流体装置捕获外周血鼻咽癌细胞从而实现对鼻咽癌的无创诊断。

1 材料与方法

1.1 资料

2016年11月至2017年5月本院收治的鼻咽癌初治患者20例，男性13例，女性7例，中位年龄 43 (32～72)岁。全部患者经鼻咽活检病理证实为鼻咽癌，病理类型均为低分化鳞癌。所有患者均接受鼻咽、颈部CT扫描，电子鼻咽镜及胸部正侧位片，腹部B超及相关实验室检查以明确分期及远处转移，若患者有骨痛症状则行全身骨扫描。临床分期按92分期标准进行TNM分期。健康体检者20例，其中男性10例，女性10例，中位年龄32岁。

1.2 微流体芯片的制备

PDMS 微流控芯片制作由苏州文灏芯片科技有限公司生产。通过光刻工艺制作SU-8模具，采用PDMS脱模工艺制作PDMS阵列 基片和盖片，通过键合工艺形成封闭微流体芯片。芯片由进样口、反应室、出样口组成，反应室内设置叉排的微绕流柱，微绕流柱为圆形，直径为45 μm，间距为100 μm。

1.3 微流体芯片的内部修饰

通过两步法将生物素标记的适配子,首先通过物理吸附将亲和素(Invitrogen公司)结合到微流体芯片的反应室内壁上，通过生物素亲和素反应将标记由生物素的适配子固定在反应室内表面。通过荧光显微镜判断适配子固定在反应室的情况。

1.4 细胞培养

人鼻咽癌细胞 (C666)、正常人鼻咽上皮细胞(NP69)本室保存。无血清培养基keratinocyte-SFM、1640培养基、胎牛血清购自 GIBICO 公司。C666细胞用含有10%热灭火胎牛血清100IU/ml青链霉素的1640培养基培养，NP69细胞用keratinocyte-SFM无血清培养基进行培养。所有培养的细胞均用DPBS磷酸缓冲液洗涤2次后用0.25%胰蛋白酶消化传代或收获细胞。

1.5 适配子缓冲液

适配子由大连宝生物合成。适配子序列如下FITC-5`-ACCGACCGTGCTGGACTCTACCGCGCAGTGAGGTGAGTGGGGTAGGTTGTTACGTTTCCAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3`-Biotin。洗脱缓冲液： 4.5 g/L葡萄糖，5 mM MgCl2的DPBS磷酸缓冲液。结合缓冲液： 0.1 mg/ml 酵母 tRNA，1 mg/ml BSA 的洗涤缓冲液。捕获缓冲液：结合缓冲液和淋巴细胞分离液以1∶1比例混合组成。

1.6 细胞捕获实验

细胞捕获实验前先将细胞悬液调整浓度到106/ml，用vybrant DiI或DiD细胞染色液进行染色。染色步骤按照说明书进行，细胞在37 ℃染色5 min，洗涤缓冲液洗涤一次，用捕获缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度到106/ml，储存在冰上备用。

细胞捕获实验的步骤首先用1 mg/ml亲和素在微流控芯片中作用1 min，结合缓冲液冲洗3次。30 μM生物素标记适配子作用1 min，用结合缓冲液冲洗3次。微泵泵入细胞混悬液(C666和NP69)到微流体芯片反应室内，结合缓冲液冲洗3次，洗脱缓冲液洗脱，荧光显微镜观察捕获细胞的数量。

1.7 微流体芯片捕获全血中鼻咽癌细胞

全血取自健康体检者的EDTA抗凝血。胰蛋白酶会对细胞产生较大损失，因此制备细胞悬液采用无酶细胞消化液进行消化细胞，获得的单个鼻咽癌细胞加入健康体检者全血中，通过微流体芯片捕获鼻咽癌细胞，计算最终鼻咽癌细胞捕获效率。全血中鼻咽癌细胞的终浓度为10、100、1 000、10 000个细胞/ml，每个浓度重复3次。

用微泵将细胞悬液或全血标本经过微流体装置的进样口输送到反应室，连接反应室出样口的是细胞收集器。为了避免全血的性状改变，全血肿瘤细胞分离过程中没有加入缓冲液。为防止细胞在泵入过程中浓度不均一，在细胞出入端全血中放入微型磁力搅拌棒，全血细胞在出入过程中不会下沉且保持浓度均一。

1.8 临床标本的收集及检测

抽取患者及健康体检者5 ml外周血置于 EDTA抗凝管，4 ℃保存备用。用1.6的方法捕获保存的外周血细胞，洗脱反应室内细胞离心计数。统计学方法采用t检验。

2 结果

2.1 微流体对靶细胞的分离

用鼻咽癌细胞C666作为靶细胞，鼻咽正常细胞NP69作为对照细胞，用结合了生物素标记的适配子的微流体可以实现对鼻咽癌细胞的富集。1 ml的样本中含有靶细胞与对照细胞的比为1∶1 000，终细胞数为106，实验前分别对两种细胞进行预染，鼻咽癌细胞C666用Vybrant DiI预染，染色后细胞颜色为红色，鼻咽正常细胞NP69用Vybrant DiD 染色，染色后细胞颜色为蓝色。经过微流体芯片富集后荧光显微镜计数靶细胞的捕获效率达到96%。

2.2 全血鼻咽癌细胞的分离

模拟分离患者外周血中循环肿瘤细胞，将培养的鼻咽癌细胞加入到收集的外周血中，1 ml外周血中加入不等数量的鼻咽癌细胞C666，用微流体装置进行鼻咽癌细胞分离富集，鼻咽癌细胞的捕获效率均可以达到90%以上，不同细胞含量的的微流体捕获细胞数量如图1，从图上可以看出微流体装置检测外周血的范围为10～10 000个。

2.3 初治鼻咽癌患者外周血检测结果

比较鼻咽癌患者和健康体检者外周血经过微流体芯片检测收获的细胞，发现鼻咽癌患者外周血收获的细胞数明显高于健康体检者，统计学有显著差异(P<0.01)，见图2。

图1 全血标本中鼻咽癌细胞捕获范围

图2 鼻咽癌初治患者和健康对照组捕获细胞比较

3 讨论

肿瘤的液态活检是目前肿瘤诊断与治疗研究的热点，肿瘤患者的外周血循环肿瘤细胞可以通过多种检测手段进行检测[3-4]。目前对CTC的检测方法主要有①流式荧光检测仪(Luminex100TM多功能流式点阵仪)，主要检测乳腺癌外周血中8种循环肿瘤细胞基因；②免疫磁珠分离细胞，将单抗连接在磁珠上对靶细胞进行分离，可以从106-7单核细胞中分离出1个肿瘤细胞；③基于免疫磁性分离原理发展起来的CellSearch系统[5]，它是一种半自动的CTC检测仪，将epCAM包被于磁珠表面分离CTC,目前已被美国FDA批准用于监测乳腺癌预后及治疗效果;④膜过滤法，通过肿瘤细胞体积大于外周血细胞而把肿瘤细胞分离出来，再用抗体标记识别肿瘤细胞。以上这些方法(除基因检测外)主要采用在具有高亲和力的抗体(CK8、 CK18、CK19、epCAM)捕获计数CTC[6-8]。目前鉴定出能够结合肿瘤细胞或肿瘤细胞株的抗体非常少，抗体存在高水平的脱靶交叉反应[9]，需要特定的条件保持蛋白探针的功能活性是以抗体为基础的捕获CTC方法的主要缺陷，同时也限制了这项技术在临床中对多种肿瘤的检测。

相对于抗体适配子具有更好的亲和力更高的特异性，容易合成保存运输，可以进行表面修饰，因此近年来也有报道适配子捕获外周血肿瘤细胞,其外周血肿瘤细胞的捕获效率从70%到98%不等[10-12]。本研究通过前期研究筛选出的鼻咽癌适配子[13]结合微流体平台实现了对鼻咽癌外周血肿瘤细胞的检测，鼻咽癌细胞的捕获效率达到90%，优于一些研究报道的肿瘤细胞捕获效率[14]。

本研究证实了以适配子为基础的微流体可以分离全血中的肿瘤细胞，通过用微绕流芯片对临床标本和健康对照组进行检测，发现20例健康对照组外周血中捕获细胞数为0到1，鼻咽癌初治患者照外周血捕获细胞数从2个到93个不等，对发现鼻咽癌细胞数适配子微流体以其检测标本不需要预处理，检测速度快，检测下线低等优势将在临床诊断中有广阔的前景。

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