白细胞介素增强因子3对胃癌细胞侵袭转移能力的影响及机制

刘羽，李勇，赵雪峰，檀碧波，贾楠，张萌，王冬

（河北医科大学第四医院 1.外三科，2.肝胆外科，河北 石家庄050011）

临床胃癌患者多处于进展期，就诊时往往已存在局部转移甚至远处转移。胃癌细胞具有较强的侵袭和迁移能力，这是导致胃癌转移的重要原因[1-2]。因此，寻找在胃癌侵袭转移过程中发挥重要调控功能的基因对于抑制肿瘤细胞迁移、延缓肿瘤进展有益。白细胞介素增强因子3（interleukin enhancer-binding factor 3，ILF3）是近年来发现的与生理及病理状态有关的新基因，研究显示一些疾病中ILF3表达异常[3-5]，但ILF3在胃癌转移中的作用及机制迄今报道极少。故本研究通过对临床组织及胃癌细胞株的研究，探讨了ILF3基因与胃癌侵袭转移的关系，并对其中的分子机制进行了初步分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2014年1月-2015年12月，于河北医科大学第四医院确诊并行手术治疗的胃癌患者112例为研究对象。其中，男性74例，女性38例；年龄34～81岁，平均（56.38±8.79）岁。所有患者均经手术切除原发肿瘤。患者术前未经过放化疗及生物治疗。取患者的肿瘤原发灶石蜡标本连续4μm切片用于免疫组织化学检测。另于患者中取62例阳性淋巴结转移者的淋巴结及50例癌旁正常胃黏膜的石蜡标本进行免疫组织化学检测。

1.2 细胞株及主要试剂

人胃癌高分化细胞株MKN28、中分化胃癌细胞株SGC7901、低分化胃癌细胞株BGC823、MGC803取自本院科研中心；胃上皮细胞株GES-1购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。LipofectamineTM2000转染试剂为美国Invitrogen公司产品；改良杜氏伊格尔培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清为美国Gibco公司产品；噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、Trizol、 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒、蛋白提取试剂盒为美国Sigma公司产品；各基因的引物及ILF3-siRNA由上海生工公司设计合成。ILF3、基质金属蛋白酶 7（matrix metalloproteinase-7，MMP-7）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、基质金属蛋白酶抑制剂 1（matrix metallo-proteinase inhibitor-1， TIMP-1）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体为美国Santa Cruz公司产品。

1.3 方法

1.3.1 SP法检测胃癌组织、癌旁组织、转移淋巴结组织中ILF3蛋白的表达 临床标本石蜡组织脱蜡水化，进行SP染色。操作步骤严格按照免疫组织化学试剂盒说明书操作。结果判断由2位病理专业人员盲法观察切片结果，切片均随机取5个400倍视野，每视野计数100个细胞。ILF3、MMP-7、MMP-9、TIMP-1蛋白以细胞质或细胞膜出现黄色或棕色染色为阳性。采用2次计分法计算阳性率：①按染色强度进行计分：无色计为0分，淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，褐色计为3分；②按阳性细胞比例计分：无阳性细胞计为0分，阳性细胞率＜10%计为1分，阳性细胞率11%～50%计为2分，阳性细胞率51%～75%计为3分，阳性细胞率＞75%计为4分。细胞染色强度及阳性细胞比例两者相乘，结果≤2为阴性（-），结果＞2为阳性（+）。

1.3.2 胃癌细胞株及胃上皮细胞株培养 人胃癌细胞株MKN28、SGC7901、MGC803及胃上皮细胞株GES-1于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中常规培养，取生长期细胞进行实验。

1.3.3 ILF3-siRNA转染 ILF3-siRNA序列：5'-GCG GAUCCGACUACAACUACG-3'；无关对照siRNA序列：5'-CGGCUGCAAUCGAUUGAUAGC-3’。转染前将MGC803细胞按4×105个/ml接种于6孔板中24 h，用无血清无抗生素的DMEM清洗细胞，按照转染试剂LipofectamineTM2000试剂说明书，将siRNA转染胃MGC803细胞，ILF3-siRNA浓度为40μmol/L。转染24 h后，检测转染效果。

1.3.4 MTT法检测细胞活性 MGC803细胞以5×104个/ml接种于96孔板，生长至70%～80%时转染ILF3-siRNA或control siRNA。每组设6个复孔，培养20 h后加入20μl（5 mg/ml）的MTT，继续培养4 h，弃去培养液，各孔加入150μl DMSO，室温振荡15 min，用酶标仪于波长490 nm测吸光度值（A值）。实验重复3次。

1.3.5 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 MGC803细胞消化制成单细胞悬液，调节浓度为1×106个/ml接种至6孔板，细胞生长至60%～70%时分别转染ILF3-siRNA或对照siRNA。待细胞生长至100%后弃去培养液，以PBS冲洗。无菌枪头在6孔板底部划痕，PBS洗去刮下的细胞，镜下观察伤口愈合情况。实验重复3次。

1.3.6 Transwell小室侵袭实验 Transwell小室上室用100μl Matrigel胶包被，紫外线照射。将消化好的MGC803细胞以1×106个/ml的浓度接种于6孔板，细胞生长至60%～70%时分别转染ILF3-siRNA或对照siRNA。继续培养24 h，各组分别取200μl细胞接种于Transwell小室上室，在下室加入DMEM培养基。24 h后以棉棒拭去上室的Matrigel胶和多余MGC803细胞，甲醇固定10 min，以结晶紫染色后计数穿膜的细胞数。实验重复3次。

1.3.7 qRT-PCR检测增殖和迁移侵袭相关基因mRNA表达 一步法提取MGC803细胞的总RNA，鉴定RNA的完整性、纯度及含量。取2μg总RNA逆转录为cDNA。进行qRT-PCR反应检测ILF3、MMP-7、MMP-9、TIMP-1基因的mRNA相对表达水平，采用2-ΔΔCt法进行计算。各引物序列如下。ILF3：5'-GTGTCCAATCACCAGTCCTG-3'，5'-GCTGAAGAA GTGGGAGTGTAGC-3'；MMP-7：5'-GCTGACATCATGA TTGGCTTT-3'，5'-TCTCCTCCGAGACCTGTCC-3'；MMP-9：5'-TCTTCCAAGGCCAATCCTAC-3'，5'-ATCA CCGTCGAGTCAGCTC-3'；TIMP-1：5'-ACTTCCACAGG TCCCACAAC-3'，5'-GCATTCCTCACAGCCAACAG-3'；GAPDH ：5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3'，（R）5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'。

Western blot检测 ILF3、MMP-7、MMP-9、TIMP-1蛋白表达：提取样本的总蛋白，应用Bradford法蛋白定量后，各样本取40μg检测。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulphatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离，电转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用TBST缓冲液配制的5%脱脂奶粉在室温下封闭1 h，分别加入稀释好的各一抗抗体。4℃孵育过夜，用TBST缓冲液漂洗3次，加入辣根过氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗在室温下孵育1 h，化学发光法（Chemiluminescence，ECLA）显色，对条带进行吸光度扫描，以目的蛋白与内参蛋白的比值代表目的蛋白的表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较应用SNK-q检验；计数资料以率或百分比表示，应用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ILF3在胃癌组织、癌旁组织、转移淋巴结组织中的表达

免疫组织化学检测（IHC）结果显示，ILF3蛋白在转移淋巴结阳性率最高80.65%（50/62），在胃癌组织中次之64.29%（72/112），在癌旁组织中阳性率最低24.00%（12/50），3组阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 胃癌组织、癌旁组织、转移淋巴结组织中ILF3蛋白表达情况 （IHC ×400）

2.2 胃癌组织ILF3蛋白表达与临床病理特征的关系

结果发现，肿瘤浸润较深、分化程度低、淋巴结转移及TNM分期不同的ILF3蛋白阳性率差异有统计学意义（χ2=7.169、4.865、7.009和6.728，P=0.007、0.027、0.008和0.010）。其他病理参数的ILF3蛋白表达情况差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 胃癌组织ILF3蛋白表达与临床病理特征的关系 例

2.3 不同细胞株中ILF3蛋白表达情况

Western blot结果显示，ILF3蛋白在4株胃癌细胞株表达均高于胃上皮细胞株GES-1，差异有统计学意 义（t=10.196、9.277、6.969和 4.812，P=0.000、0.000、0.002和0.009），在MGC803中ILF3蛋白表达最强。故选择MGC803细胞为后续实验材料。见表2、图2。

表2 不同细胞株中ILF3蛋白表达的相对强度（n=3，±s）

表2 不同细胞株中ILF3蛋白表达的相对强度（n=3，±s）

注：†与GES-1比较，P＜0.05

不同细胞株 ILF3蛋白强度BGC823 1.012±0.092†MGC803 1.142±0.131†MKN28 0.785±0.084†SGC7901 0.624±0.068†GES-1 0.381±0.055

图2 不同细胞株中ILF3蛋白表达情况

2.4 ILF3-siRNA转染对MGC803细胞ILF3表达的影响

Western-blot结果显示，以40μmol/L转染MGC803细胞48 h后，细胞中ILF3蛋白表达低于对照组及空白组，差异有统计学意义（F=20.494，P=0.002；对照组与空白组q=-2.687，对照组与ILF3-siRNA组q=6.144，空白组与ILF3-siRNA组q=8.831）。见表3、图3。

表3 干预后各组ILF3蛋白表达的相对强度（n=3，±s）

表3 干预后各组ILF3蛋白表达的相对强度（n=3，±s）

注：†与对照组及空白组比较，P＜0.05

组别 ILF3蛋白强度对照组 0.644±0.084空白组 0.686±0.072 ILF3-siRNA组 0.328±0.041†

图3 ILF3-siRNA对MGC803细胞ILF3蛋白表达的影响

2.5 ILF3-siRNA转染对MGC803细胞活性的影响

40μmol/L转 染 MGC803细 胞 48 h后，ILF3-siRNA组细胞活性（0.426±0.062）低于对照组（0.778±0.079）及空白组（0.792±0.081），3组比较差异有统计学意义（F=56.369，P=0.000；对照组与空白组q=-2.495，对照组与ILF3-siRNA组q=11.576，空白组与ILF3-siRNA组q=14.071）。见表4、图4。

表4 干预后各组细胞活性情况 （n=6，±s）

表4 干预后各组细胞活性情况 （n=6，±s）

注：†与对照组及空白组比较，P＜0.05

组别 细胞活性对照组 0.778±0.079空白组 0.792±0.081 ILF3-siRNA 组 0.426±0.062†

图4 ILF3-siRNA转染对MGC803细胞活性的影响

2.6 ILF3-siRNA转染对MGC803细胞侵袭迁移能力的影响

ILF3-siRNA转染MGC803细胞后，划痕实验发现转染ILF3-siRNA的MGC803细胞迁移能力明显低于对照组和空白组，3组比较差异有统计学意义（F=75.713，P＜0.05；对照组与空白组q=0.027，对照组与ILF3-siRNA组q=15.085，空白组与ILF3-siRNA组q=15.058）。Transwell小室实验发现转染ILF3-siRNA的MGC803细胞侵袭能力低于对照组和空白组，3组比较差异有统计学意义（F=52.771，P＜0.05；对照组与空白组q=-3.001，对照组与ILF3-siRNA组q=10.810，空白组与ILF3-siRNA组q=13.812）。见表5。

2.7 ILF3-siRNA转染对MGC803细胞MMP-7、MMP-9、TIMP-1基因表达的影响

以40μmol/L转染MGC803细胞48 h后，MMP-7、MMP-9基因mRNA和蛋白表达下调，而TIMP-1基因mRNA和蛋白的表达上调（P＜0.05）。对照组与空白组各基因表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

表5 ILF3-siRNA转染对MGC803细胞侵袭迁移能力的影响 （n=6，±s）

表5 ILF3-siRNA转染对MGC803细胞侵袭迁移能力的影响 （n=6，±s）

注：†与对照组及空白组比较，P＜0.05

组别 划痕实验结果 Transwell小室侵袭实验结果ILF3-siRNA组 22.17±2.23† 13.33±1.97†对照组 39.50±4.04 25.17±2.79空白组 40.67±2.58 26.50±3.02

图5 ILF3-siRNA转染对胃癌MGC803细胞MMP-7、MMP-9、TIMP-1基因表达的影响

3 讨论

胃癌患者的预后较差，目前进展期胃癌患者5年生存率低于40%[6]。虽然胃癌的诊治技术已取得了很大进展，但胃癌治疗的远期效果改善依然不能令人满意。胃癌预后差的重要原因在于胃癌细胞有较强的侵袭及迁移能力[7]，这种能力使胃癌早期即可发生转移；而且在转移过程中肿瘤细胞还会发生进一步变化[8]，导致治疗措施失效，从而成为胃癌复发及进一步转移的原因。因此，确定在胃癌侵袭转移中发挥重要的基因对胃癌综合诊治有重要意义。ILF3是近年来发现的与肿瘤关系密切的新基因。有研究发现ILF3/p21通路与调控细胞周期有关，从而参与B细胞慢性淋巴细胞白血病的进展[9]。还有研究发现ILF3基因编码的NF90蛋白对周期素E1（Cyclin E1）有直接调控作用，可以通过调节细胞周期而参与肝细胞癌的增殖[10]。本研究发现，胃癌组织中ILF3蛋白的表达比正常胃黏膜明显增强，且与肿瘤的分化程度、淋巴结转移情况有关，提示ILF3蛋白可能在胃癌的进展中发挥了作用。研究还发现转移淋巴结组织中ILF3蛋白表达阳性率高于原发灶，说明ILF3蛋白可能在肿瘤转移过程中通过增强表达促进胃癌的转移。

为了解ILF3基因在胃癌细胞侵袭转移中发挥的作用，本研究进行了体外实验。通过Western blot筛选，发现低分化黏液腺癌来源的MGC803细胞中ILF3蛋白表达最强，故进一步研究中对MGC803细胞的ILF3基因进行了抑制。结果发现，MGC803细胞中内源性ILF3基因受到抑制后肿瘤细胞的活性减弱，侵袭迁移能力也降低。说明ILF3基因在胃癌细胞的侵袭迁移过程中发挥了促进作用，抑制ILF3基因表达可能抑制肿瘤进展。

为初步了解ILF3基因参与胃癌侵袭迁移的机制，本研究检测了抑制ILF3基因前后肿瘤侵袭迁移相关基因MMP-7、MMP-9、TIMP-1基因的表达变化。MMPs-TIMPs是影响肿瘤侵袭转移的重要基因家族，MMP-7、MMP-9、TIMP-1是其中重要成员，MMP-7、MMP-9对促进胃癌细胞的侵袭迁移有重要作用，而TIMP-1则具有抑制MMP-9等基因的作用[11-14]。本研究显示，抑制MGC803细胞中ILF3表达后细胞的MMP-7、MMP-9表达降低，而TIMP-1的表达升高，提示胃癌细胞中ILF3基因可能通过调节MMP-7、MMP-9、TIMP-1参与了胃癌细胞的侵袭转移过程，但深入的分子机制还有待深入研究。

[1]YANG Z G,GAO L,GUO X B,et al.Roles of long non-coding RNAs in gastric cancer metastasis[J].World J Gastroenterol,2015,21(17): 5220-5230.

[2]SHI Z,WEI Q,SHE J.MicroRNAs in gastric cancer metastasis[J].Crit Rev Eukaryot Gene Expr,2014,24(1): 39-53.

[3]CASTELLA S,BERNARD R,CORNO M,et al.Ilf3 and NF90 functions in RNA biology[J].Wiley Interdiscip Rev RNA,2015,6(2): 243-256.

[4]LI Y,MASAKI T,SHIMAKAMI T,et al.hnRNP L and NF90 interact with hepatitis C virus 5’-terminal untranslated RNA and promote ef fi cient replication[J].J Virol,2014,88(13): 7199-7209.

[5]WEN X,HUANG X,MOK BW,et al.NF90 exerts antiviral activity through regulation of PKR phosphorylation and stress granules in infected cells[J].J Immunol,2014,192(8): 3753-3764.

[6]LI Y,ZHAO Q,FAN L Q,et al.Analysis of lymph node dissection range-related factors for early gastric cancer operation[J].Hepatogastroenterology,2013,60(125): 971-974.

[7]WANG J,QU J,LI Z,et al.A prognostic model in metastatic or recurrent gastric cancer patients with good performance status who received fi rst-line chemotherapy[J].Transl Oncol,2016,9(3): 256-261.

[8]LI Y,TAN B B,FAN L Q,et al.Heterogeneity for COX-2,multidrugs resistance between primary tumors and regional lymph node metastases of gastric cancer[J].Tumori,2012,98(4): 516-522.

[9]AGNOLETTO C,BRUNELLI L,MELLONI E,et al.The antileukemic activity of sodium dichloroacetate in p53mutated/null cells is mediated by a p53-independent ILF3/p21 pathway[J].Oncotarget,2015,6(4): 2385-2396.

[10]JIANG W,HUANG H,DING L,et al.Regulation of cell cycle of hepatocellular carcinoma by NF90 through modulation of cyclin E1 mRNA stability[J].Oncogene,2015,34(34): 4460-4470.

[11]SUI H,XU H,JI Q,et al.5-hydroxytryptamine receptor(5-HT1DR) promotes colorectal cancer metastasis by regulating Axin1/β-catenin/MMP-7 signaling pathway[J].Oncotarget,2015,6(28): 25975-25987.

[12]MERDAD A,KARIM S,SCHULTEN H J,et al.Expression of matrix metalloproteinases (MMPs) in primary human breast cancer: MMP-9 as a potential biomarker for cancer invasion and metastasis[J].Anticancer Res,2014,34(3): 1355-1366.

[13]AN H J,LEE Y J,HONG S A,et al.The prognostic role of tissue and serum MMP-1 and TIMP-1 expression in patients with nonsmall cell lung cancer[J].Pathol Res Pract,2016,212(5): 357-364.

[14]FAN H,JIANG W,LI H,et al.MMP-1/2 and TIMP-1/2 expression levels,and the levels of collagenous and elastic fi bers correlate with disease progression in a hamster model of tongue cancer[J].Oncol Lett,2016,11(1): 63-68.