神经细胞分化中microRNA-134靶基因网络功能分析*

苏立宁，尹海峰，宋小青，魏会平

（河北北方学院基础医学院，河北 张家口 075000）

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一种重要的多功能干细胞，具有取材方便，分化易控制等特点。研究表明，在合适的诱导条件下BMSCs可向成骨细胞、肌细胞、软骨细胞、肝细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等多方向分化[1-7]。研究[8-9]发现在特殊的培养条件下，BMSCs可分化为神经细胞，但有关其分子机制还有待进一步研究。

MicroRNAs，是一种短的非编码单链RNA，长约20～24个核苷酸，通过碱基互补配对原则，与mRNA结合，直接靶向切割mRNA或抑制靶基因的翻译对转录后基因表达进行调控。MicroRNAs通过与mRNA结合可调控神经系统发育和功能[10]，脑特异性microRNA-134在神经突生成及突触成熟等发育阶段发挥调控作用[10-11]。研究[12]表明microRNA-134通过抑制单丝氨酸蛋白激酶1（LIM-kinase 1，LIMK1）控制神经突的生成或脊柱的生长，通过降低胚胎干细胞关键蛋白NANOG和肝受体类似物LRH1的转录后表达调节小鼠BMSCs的分化[13]。本实验推测microRNA-134在神经分化过程中发挥重要作用。

为了进一步验证microRNA-134在BMSCs向神经分化过程中的功能，本实验检测了神经分化过程中microRNA-134表达量的变化，利用生物信息学软件对其靶基因进行预测，结合所研究的目标，分析与神经分化相关的基因。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4～6周龄大鼠3只，购自河北北方学院实验动物中心。

1.2 主要试剂

DMEM购自美国Gibco公司，碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）购自上海PrimeGene Bio-Tech公司，RNA提取试剂盒和兔抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）引物购自日本TaKaRa公司，兔抗巢蛋白（nestin）和NSE购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 BMSCs的分离与培养

颈椎脱臼法处死大鼠，75%的酒精浸泡10 min消毒，无菌条件下取出股骨，置无菌PBS液中清洗2次，露出骨髓腔，用5 ml的无菌注射器吸取含有10%胎牛血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔，收集洗液，置无菌培养瓶中培养，72 h后换液去除未贴壁的细胞，每隔3 d换液1次，待细胞密度达80%左右时按1∶2进行传代，直至第4代。流式细胞仪检测BMSCs的表面标志物。

1.4 BMSCs诱导分化为神经细胞

取第4代的细胞分为两组，对照组不加任何因子，诱导组加入含20 ng/ml EGF和20 ng/ml bFGF的诱导液。对照组每隔3 d换液1次，诱导组每隔2 d半量换液。

1.5 MicroRNA-134表达量分析

收集对照组细胞和诱导组细胞（诱导1、2、3、4 d）。利用RNA提取试剂盒分别提取两组总RNA。采用microRNA-134逆转录引物，逆转录为cDNA，采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测microRNA-134在两组不同时间点的表达量变化，反应体系为95℃ 5 min，94℃ 30 s 40个循环，60℃30 s，72℃ 30 s。成熟 microRNA-134的正向扩增引物为5'-CGTGTGACTGGTTGACC-3'，反向引物5'-GAGCAGGCTGGAGAA-3'。内参β-actin 的正向引物为5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，反向引物为5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。采用Ct值比较法[14]，比较两组的表达差异。

1.6 MicroRNA-134靶基因预测及GO功能富集

利用数据库miRWalk[15]对microRNA-134靶基因进行预测。预测得到的靶基因上传至DAVID数据库进行Gene Ontology（GO）功能富集分析，筛选与神经分化相关的基因，应用Fisher’s exact test方法选取P＜0.05注释基因条目。

1.7 神经分化相关基因蛋白互作网络构建及分析

将选取的神经分化相关基因输入到STRING 10[16]数据库中，选取交互作用评分＜0.7（高等可信度）的互作关系构建神经分化相关基因的蛋白互作网 络（protein- protein interaction network，PPI）。 网络分析采用生物图表可视化工具Cytoscape3.2.1软件[17]进行，且利用“Network Analyzer”工具对各节点的“度”进行计算。“度”代表了与目标蛋白相互作用的蛋白的数量。网络中，节点越大，“度”越大。利用 Cytoscape3.2.1软件中的“ClusterONE”工具对蛋白质相互作用网络进行功能模块分析，筛选标准为minimum size=6，minimum density=0.05，P＜0.05。

1.8 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各指标间比较采用重复测量设计的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs的鉴定结果

大鼠骨髓中获取的间充质干细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养48 h后半量换液，待细胞密度达80%～90%传代，3代细胞生长较稳定，密度较均匀，形态以长梭形为主，符合BMSCs的细胞形态特征。待细胞传至4代，流式细胞仪检测细胞的表面标志物，检测结果显示，标志物CD29和CD90表达阳性，CD34和CD45表达弱阳性，符合骨髓间充质干细胞的特点（见图1）。

图1 BMSLs的鉴定结果

2.2 BMSCs向神经细胞的诱导分化结果

向传至第4代的BMSCs中加入含20 ng/ml EGF和20 ng/ml bFGF的诱导液，诱导2～3 d后，出现少量的神经样细胞；继续诱导4 d，大部分已分化为神经样细胞（见图2A）。免疫组织化学法检测分化后神经细胞标志物nestin和NSE的表达量，结果为阳性（见图2B）。收集对照组诱导1～4 d的细胞，利用qRTPCR进行NSE基因表达量的检测，结果显示诱导4 d后，NSE基因的表达量达到高峰。与对照组相比，诱导组1～4 d后表达量分别升高1.08、1.25、2.01和2.94倍（见图2C），其中，诱导组第3和4天表达量与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 BMSCs诱导分化后microRNA-134表达量的变化

诱导组与对照组细胞培养1、2、3及4 d的microRNA-134表达量比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点间的microRNA-134表达量有差别（F=69.711，P=0.003），②诱导组与对照组细胞的microRNA-134表达量有差别（F=18.096，P=0.021），诱导组与对照组相比microRNA-134表达量较高，可诱导BMSCs细胞向神经细胞分化，③不同诱导时间和诱导方法间存在交互作用，诱导组与对照组的不同诱导时间有差别（F=5.390，P=0.014）。见表1。

2.4 MicroRNA-134靶基因网络相互作用分析

为了进一步研究microRNA-134在神经分化中的作用，利用在线数据库miRWalk预测microRNA-134靶基因，得到1 220个靶基因。将靶基因输入到DAVID软件6.7中进行GO（P＜0.05）功能富集分析，选取与神经分化相关的GO功能组：GO 0030182和GO 0048667（见表2）。

2.5 GO 0030182和GO 0048667 PPI网络分析

图2 BMSCs分化为神经细胞的鉴定结果

表1 microRNA-134表达量的变化 （±s）

表1 microRNA-134表达量的变化 （±s）

组别 第1天 第2天 第3天 第4天对照组 0.018±0.002 0.019±0.002 0.021±0.002 0.021±0.001诱导组 0.037±0.003 0.041±0.003 0.045±0.003 0.050±0.002

表2 与神经分化相关的microRNA-134靶基因

为了预测与神经元分化相关的靶基因（GO 0030182和GO 0048667）及与其他基因之间的蛋白质相互作用，利用STRING10数据库构建PPI网络，然后利用生物图表可视化工具Cytoscape3.2.1软件进行网络分析，且利用“Network Analyzer”工具对各节点的“度”进行计算（见图3）。构建结果显示，21个靶基因蛋白均与STRING数据库中蛋白质匹配，这21个基因为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3，CASP3）、靶向整合素β1（Integrinβ1，ITGB1）、血小板激活因子乙酰水解酶bata1（plateletactivating factor acetylhydrolase，PAFAH1B1）、蛋白激酶C（Protein kinase C alpha，PRKCA）、酪氨酸蛋白激酶A4（tyrosine protein kinase A4，EPHA4）、肝配蛋白A2（Ephrin-A2，EFNA2）、NK6 同源框蛋白 1（NKX6-1）、神经细胞黏着分子（neural cell adhesion molecule，NRCAM）、突触融合蛋白结合蛋白1基因（synaptic fusion protein binding protein 1 gene，STXBP1）、钾离子通道相关作用蛋白2（Kv channel-interacting protein 2，KCNIP2）、蛋白磷酸酶ABI2、腺嘌呤核苷A2a受体（adenine nucleoside both A2a receptors，ADORA2A）、接触蛋白2（contactin-2，CNTN2）、锌指转录因子DST、叉头状转录因子 FOXA1（forkhead box A1）、SEPT2（septin-2）、微管相关蛋白 Doublecortin（DCX）、ETS变异基因1（ETS gene variant 1，ETV1）、腱蛋白样蛋白1（cordin-like 1，CHRDL1）、生长休止蛋白7（growth arrest-specific，GAS7）和蛋白酪氨酸磷酸酶受体M（protein tyrosine phosphatase receptor type M，PTPRM）。利用Cytoscape3.2.1软件中的“ClusterONE”工具进行了模块分析，结果12个基因被聚集在模块中（见图4）。

图3 MicroRNA-134靶基因PPI网络分析

图4 MicroRNA-134靶基因相互作用网络的11个模块 黄色节点代表靶基因，红色节点代表与靶基因蛋白相互作用的蛋白。节点越大，“度”越大

3 讨论

MicroRNAs通过作用于靶基因调控细胞分化等各种生物学过程。

MicroRNA-134具有脑特异性，在神经中枢中高表达。而microRNA-134在BMSCs诱导分化为神经细胞过程中的作用机制还有待研究。

许多研究已证明EGF和bFGF联合作用可以诱导BMSCs向神经细胞分化[18]，因此本实验选择的诱导剂为EGF和bFGF。利用qRT-PCR检测microRNA-134在各实验组的表达量变化，诱导组随诱导时间的递增表达量升高。因此初步假设microRNA-134在促进BMSCs分化为神经细胞过程中发挥作用。以往的研究证明[19]，microRNA-134通过降低转录因子蛋白FOXM1的表达量调控人类多能干细胞分化发挥作用。神经系统中，LIMK1通过抑制microRNA-134的表达量调节神经突的生成、脊柱的生长及树突棘的大小[12，20]。另外还有研究发现沉默信息调节因子2相关酶1通过转录抑制因子复合体作用于microRNA-134调控神经突触的可塑性[21]。本实验初步验证了在神经分化过程中microRNA-134表达量升高，与前人的结论一致。MicroRNA-134以哪些基因为靶基因调控神经分化，在本文中进行了理论的预测。

本文以miRWalk和DAVID数据库为依据，以GO功能为基础筛选了与神经分化相关的microRNA-134靶基因（GO 0030182和GO 0048667），并构建了PPI网络图，通过ClusterONE功能模块分析发现CASP3，ITGB1，PAFAH1B1，PRKCA，EFNA2，NKX6-1，NRCAM，STXBP1，KCNIP2，ABI2，CNTN2，FOXA1等12个基因聚集在11个模块中发挥作用，说明这12个基因作用在神经分化中比较重要。NKX6-1，是一种同源框转录因子，通过调控3个神经元轴突导向分子的表达量控制神经元轴突的生长[22]，且通过与PR结构域蛋白12的交叉抑制作用促进中间神经元的生长[23]。FOXA1，作为一种转录因子，可调控中脑多巴胺能神经元的分化[24]，CNTN2在早期脑神经节和脊髓运动神经元中不表达，而在成熟神经元中表达[25]。

综上所述，本文初步验证了microRNA-134在促进BMSCs向神经细胞分化的过程中发挥重要作用，应用生物信息学的方法分析了在神经分化中发挥作用的microRNA-134的靶基因，并筛选了与神经分化相关的12个关键蛋白，但这些蛋白的作用还需实验的进一步验证。

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